2003年,两年后人类基因组计划出版一张约20000个基因的序列定义智人,一群瑞典研究人员推出了人类蛋白质图谱(HPA)——大规模努力地图由这些基因编码的蛋白质在人体组织和细胞的表达。

研究员删除从一个小的部分组织样本分析的蛋白表达人类蛋白质Atlas项目。信贷:人类蛋白质图谱

一些蛋白质被本地化,马Uhlen解释说,一种蛋白质在斯德哥尔摩皇家理工学院的研究员和HPA的首席研究员。人类蛋白质组的综合地图集将为更加复杂的蛋白质功能的研究,他说。它将揭示膜蛋白的数组,渡轮分子的细胞,并公开检查参与组成分泌腺的”——蛋白质分泌细胞在健康和疾病。它将引导探索生理遗传变异的影响。它有助于药物开发者预测候选药物可能与蛋白质或交互导致副作用(见“使用人类的蛋白质图谱”)。

项目的年度初步版本的地图和数据已经产生了惊喜,病理学家弗雷德里克·Ponten说在瑞典乌普萨拉大学和下丘脑的创始人之一。例如,地图显示,大约3500个基因编码蛋白特有的一种组织类型或一小群组织,而睾丸包含这些蛋白质的三分之一,比在其他任何器官1(见“蛋白质,我们自己”)。

去年11月,该小组计划上传数据完成初稿的人类蛋白质组。总的来说,它包括近1500万高分辨率彩色组织和细胞的显微图,并提出了数据约有80%的人类蛋白质。这个信息是人类细胞系和组织从46 - 44 360人正常组织样本类型从144人,和20个最常见的癌症类型,从216人。“最令人兴奋的是它的规模,“Ponten说。另一个项目——被称为亚细胞蛋白质图谱——将定位蛋白质在细胞内,并将在明年完成。

样品用于HPA来自人同意捐献组织在不同的情况下当他们接受治疗。按照瑞典研究伦理指南,所有样品都是匿名,这样他们不能追溯到他们的捐赠者。

下丘脑不是唯一protein-mapping冒险。其他工作包括人类蛋白质组计划,这与HPA松散但使用一些不同的策略,和项目在个别实验室或研究人员组。人类蛋白质组的两个草案,质谱分析的基础上,提出了这个问题自然2,3。在这种方法中,组织处理和蛋白质分解成碎片。碎片电离,然后根据他们的质量和电荷分离,这有助于衡量,排序和识别的蛋白质。

下丘脑是唯一大规模映射基于antibody-profiling方法,化学污渍和抗体用于定位和识别蛋白质组织(见“表达自我”)。项目的科学家们使用了“蛮力”的方法,包括一些自动化但是需要很多手工步骤。将他们的技术应用到许多蛋白质在体内是艰巨——人类蛋白质的总和超过的基因数量到目前为止,并可能在数百万。

克努特和爱丽丝•瓦伦堡基金会的资金在斯德哥尔摩,HPA研究人员在13 - 140科学家团体工作主要在斯德哥尔摩,乌普萨拉或孟买,印度——划分工作。他们扩大标准蛋白质组学方法,如免疫组织化学、抗体和污渍用于可视化蛋白质在组织样本,和免疫印迹检测的特异性抗体。

需要这样的证实——通常,不同的方法得出互相矛盾的结果。研究人员花了时间、精力和资源,以确保他们使用的抗体的工作预期,开发可靠的方式来解释和分类的彩色样本,Uhlen说。

马赛厄斯Uhlen指导人类的蛋白质图谱。信贷:人类蛋白质图谱

扩大

研究人员也在普遍缺乏自动化在蛋白质组学,说卡洛琳的奋斗,蛋白质组学研究人员和导演HPA的乌普萨拉网站,加入这个项目什么时候开始。,情况已有所改善,在过去的十年。

的任务定位蛋白质从准备开始奋斗的组织样本和她的团队从乌普萨拉生物,负责管理组织。科学家们还查阅研究文献和蛋白质数据库和研究组织的信使核糖核酸(mRNA),一个分子,携带的信息用于生产蛋白质的DNA序列。

mRNA在2012年,研究人员开始使用高通量测序,或“RNA-seq”,使他们能够更快地获得的数据组基因表达为蛋白质在一个给定的组织。这种方法有助于验证结果基于抗体的组织资料,说的奋斗。

人类的蛋白质图谱了许多关于组织染色和大型项目经验。

组织准备包括保存在石蜡块组织样本,然后加工成微阵列,微小的组织样本组安排在一个网格,使科学家测试许多蛋白质的存在。只有一小部分使用的组织微阵列;其余的保存在一个存储库中4。微阵列,圆柱形的核心组织约1毫米直径是穿孔的石蜡块。这些核心是嵌入在另一个石蜡块行和列,然后切成薄片,放在染色的幻灯片。研究者每天生产大约100幻灯片。

技术支持

说,尽管可以自动化生产的组织微阵列的奋斗,很多可能出错,和熟练的技术人员需要故障排除和工艺。例如,她说,一个技术员需要正确的联系知道什么时候停止组织冲压,或穿孔时卡住了。所需的程度的干预在一定程度上取决于样本——纹理上的差异意味着一些组织类型比另外一些更有挑战性。例如,皮肤比脂肪更严格的乳房组织。科学家集团加快生产类似的组织类型相似的处理步骤。一些措施仍然需要手工劳动。”但当捶细胞系或癌症,你可以更容易地让一台机器因为(组织)更均匀的成分,“奋斗”说。

一旦组织样本在幻灯片上,专门处理试剂,绑定一个蛋白质,而不是另一个。另一个具有挑战性的方面的程序是一个蛋白质的浓度在一个给定的组织可以改变内部和之间的样本。在体内,蛋白质丰度变化高达100万倍。丰富的蛋白质可以沼泽更稀缺的,让他们难以探测。

总是更容易理解你的结果,如果你花了时间和精力验证试剂。

有许多类型的亲和试剂,生物和合成。下丘脑使用多克隆抗体,识别特定蛋白质的部分。他们是由注射抗原抗体的实验动物,后来收获动物产生反应。这些抗体并不相同。HPA团队开发了抗原的方法设计和抗体纯化,最大化的特异性抗体门闩蛋白质,提高它的概率只找到一种蛋白质。到目前为止,研究人员已经确认37000抗体项目。

HPA的抗体在课程开发项目可通过阿特拉斯抗体,斯德哥尔摩的HPA消磨。公司现在卖17000 HPA开发的多克隆抗体,并希望添加另一个2000年11月,玛丽安·汉森说公司的首席执行官。这组抗体是什么特别之处是,它们以一种统一的方式产生,proteome-wide, Henrik Wernerus首席科学官阿特拉斯说。

验证测试抗体之一是可靠的免疫印迹,推动通过蛋白质的凝胶由电场和分为不同分子量的碎片。片段然后转移到材料如硝基纸和探测主要抗体,感兴趣的蛋白质结合,其次是二次抗体结合主和熊一个荧光或酶标记,使检测的蛋白质。

每一步的映射过程需要时间,而且有瓶颈。例如,项目的组织幻灯片迅速堆积。自动化系统不能轻易模仿病理学家改变聚焦显微镜研究组织的蛋白质表达模式。HPA以来,自动幻灯片读者可用,现在用于补充项目的病理学家的受过教育的眼睛。

奋斗说第一张幻灯片扫描仪使用她的团队可以处理每天大约10张幻灯片。但是她需要扫描一天100多的幻灯片。现在,她说,一个科学家可以“回家,当你早上回来,他们都有”。

但即使自动滑动扫描出现,奋斗和她的同事还需要手动加载幻灯片。和第一次装载器离完美还很远。奋斗》回忆进入实验室后休息时间找到地上覆盖着玻璃,因为乐器的触手已经打破了靠墙的幻灯片。她花了多少个夜晚在电话上与公司在各个时区来解决技术问题。

幻灯片的组织部分与抗体染色和孵化看到哪些蛋白质表达。信贷:人类蛋白质图谱

奋斗》说,扩大不仅仅是数据生成和分析。“你遇到许多其他事情你没有预期,”她说。染色模式在肿瘤组织,例如,很难解释,部分原因是这些组织包含正常和病变细胞。癌细胞也显示变化——在一个肿瘤以及肿瘤类型和患者之间。鉴于这种可变性,数据需要仔细评估。

对象的教训

Ponten说HPA了许多课程关于免疫组织化学和大型项目。科学家们发现,例如,RNA-seq数据可以帮助加强免疫组织化学的结果。和他们在不同的免疫组织化学和西方的屁股之间的结果。而在免疫印迹分析蛋白质变性成二维碎片,这些探测组织样本更容易保持他们的三维(3 d)结构。这种差别可能导致不同的结果,因为一些抗体识别蛋白质只以3 d形式。

一个解决方案已经产生抗体以不同的方式,Ponten说。传统使用的抗原肽抗体,短字符串的氨基酸。的方式使抗原,HPA团队设计长蛋白质片段。50 - 150个氨基酸的片段长度和选择的可能性最高收益率独特的蛋白质,并含有两个或三个抗原表位——蛋白质抗体识别的网站。这种多样性增加的可能性产生的抗体将在西方墨迹,免疫组织化学和其他技术,Ponten说。

卡罗琳的奋斗说,幻灯片的扫描仪可以一次处理10天,但现在可以处理超过100人。信贷:人类蛋白质图谱

这些化验的结果不仅取决于抗体亲和力,但也相对丰富的靶蛋白,Uhlen说。因为它很难检测low-abundance蛋白质,抗体染色的结果应该与不同的抗体验证相同的蛋白质,例如,或通过检查RNA-seq数据确定蛋白质的RNA产生问题是出现在组织,他说。

抗体验证已经“被证明是更重要的比预期”,艾玛Lundberg说指导亚细胞蛋白质图谱项目,显示在一个细胞一个特定的蛋白质。抗体可以有亲和力的蛋白质除了他们的目标,导致大可以混淆protein-mapping结果。”最后,总是更容易理解你的结果,如果你花了一些时间和精力验证你的试剂,”她说。

的奋斗,她说,多年来,收到了很多电子邮件从科学家问当他们最喜爱的蛋白质将发表在《阿特拉斯。她可以告诉他们是要有耐心。设计的过程中,抗原有充分验证结果准备上传HPA网站,平均需要9 - 12个月。

研究人员仍然需要完善地图,Ponten说。有许多low-abundance蛋白质等。表达和一些蛋白质已被忽视,因为他们只在特定时间在开发期间,Ponten说。其他人都未被发现,因为他们出现在组织HPA才刚刚开始收集,如视网膜。

团队希望研究团体将有助于发现不准确的地图。Ponten说,它将需要至少另一个五年的管理提供研究社区HPA数据,进行了分析和评估的“教科书”的权威。