有史以来最快的钙传感器拓宽了神经元成像的潜力

论文简介

•基因编码钙指标(GECIs)是对细胞内钙离子(Ca^{2 +})在神经元激活过程中通过发光产生的流入。

•GECIs使研究人员能够深入了解大脑的工作原理，但直到现在，这些蛋白质还缺乏精确记录单个神经元中基本活动单位(称为动作电位)的能力。

•写在自然,张et al。¹描述一个标志着朝着解决这个问题迈出了一步的GECI。

迈克尔·b·瑞安和安妮·k·丘奇兰:照亮大脑的灯

想象一下，在一个夏夜划船穿过平静、黑暗的水面，无数水母发出的灿烂光芒突然改变了水面，照亮了一个隐秘的活动世界。在20世纪60年代，华盛顿星期五港实验室的科学家们收集了近1万个标本Aequorea手工制作的水母，目的是分离出导致这种自然生物发光的有机成分²．科学家们提取并纯化了一种钙敏感蛋白，并将其命名为aequorin，以及一种相关的绿色荧光蛋白(GFP)。不久之后，研究人员将纯化的水马蹄苷装入活细胞中，以跟踪Ca^{2 +}这是一种对神经元活动至关重要的离子^3.．这种通过闪光来测量神经元活动的能力彻底改变了神经科学领域，并导致了对大脑中以前未知的动态的识别。

通过向神经元注射水马苷，科学家发现细胞内Ca^{2 +}由神经元激活产生，有助于这些细胞释放神经递质相互交流的过程⁴．在aequorin首次被分离出来几十年后，另一项突破以GECIs的形式出现。aequorin和其他钙敏感染料需要人工加载到细胞中，而GECIs被设计成生物体DNA的一部分^5，6．使用最广泛的geci，被称为GCaMP家族⁷它由一种叫做钙调蛋白的钙结合蛋白和一种结合肽(一短串氨基酸)组成，融合成一种改良的绿色荧光蛋白。当Ca^{2 +}与钙调蛋白结合，这触发了融合蛋白的构象变化，从而导致GFP发光(图1a)。

尽管这些钙传感器具有潜力，但早期版本的GCaMP受到响应动力学差、钙敏感性低以及与神经元电活动相关性有限等问题的阻碍。最初版本的传感器只能检测到Ca的较大变化^{2 +}由几十个动作电位引起，反应动力学在几百毫秒的数量级上。

从那时起，大量的工作都致力于通过结构引导设计来提高GCaMP传感器的性能。后来版本的GCaMP甚至对灵敏度或速度进行了优化，“慢”变体最大限度地提高信号强度，“快”变体最大限度地提高响应动力学。GCaMP的快速变体现在可以在几十毫秒的时间内检测到钙的变化。其他的GECIs也被开发出来，它们可以发出不同波长的光来响应Ca^{2 +}使几个神经元群同时被成像。

阅读论文:快速和敏感的GCaMP钙指标成像神经种群

这些进展使科学家能够利用GECIs的多功能性、特异性和寿命。基因编码的事实使它们能够同时在许多细胞中连续表达。这促进了在活的有机体内测量苍蝇、啮齿动物和灵长类动物的大量细胞。表达GECIs的细胞类型也可以通过基因控制，这有助于研究人员了解神经回路的可变性。例如，GECIs已被用于描绘大脑皮层中具有独特钙动力学和决策作用的神经元亚群⁸．它们也被用来测量钙^{2 +}在大脑的非神经元细胞中。例如，星形胶质细胞(大脑中最丰富的非神经元细胞类型)的钙成像揭示了神经递质如多巴胺如何塑造星形胶质细胞对神经活动的反应^9，10．

尽管如此，最新的GCaMP迭代还不能可靠地识别活体大脑中“嘈杂”条件下的个体动作电位。几个研究小组一直在竞相寻找能够探测到这些变化的GCaMP变体，这些变化发生在短短几毫秒内，而不牺牲亮度。张和同事的工作为这场比赛引入了一个竞争对手，并指出了钙成像的光明前景。

龚益阳& Casey baker:下一代的时间到了

单个动作电位是神经交流的基本单元。因此，张和同事们的发展是一个重大进步。作者的GCaMP8传感器具有比现有的最先进GECIs(图1b)更快的动力学，如GCaMP7和XCaMP系列^11，12．GCaMP8传感器还避免了灵敏度和速度之间的典型权衡，即较慢的传感器动力学产生较大的光学响应。

张和同事们的传感器基于GCaMP6。作者通过设计其模块的不同版本来优化该蛋白，包括连接GFP与结合肽和钙调蛋白结构域的两个链接器^{2 +}结合。他们特别关注结合肽(在GCaMP8中是内皮型一氧化氮合酶的片段)和钙调蛋白结构域之间的界面，因为传感器的这一区域在其响应和动力学中起着至关重要的作用^12，13．然后，该团队使用了一种优化过程，包括替换许多氨基酸，并进行几轮测试，以确定性能最佳的传感器。他们在苍蝇和老鼠身上验证了这些指标的表现。GCaMP8传感器的优异性能表明，Ca^{2 +}该系列的诱导荧光与其他gcamp不同。

这一突破性的方法对神经科学至关重要

GCaMP8传感器的快速动力学和高精度将使研究人员能够分析以前只能通过电测量或基因编码电压指示器(GEVIs)来研究的活体动物现象，GEVIs通过荧光对电压变化做出反应(很像GECIs对钙的反应)。到目前为止，人们一直认为GECIs和GEVIs报告了不同类型的神经活动——GEVIs决定动作电位的时间，GECIs揭示了神经元区室中的关键活动(例如，通过测量Ca^{2 +}接收其他神经元信号的树突的动态过程)¹⁴．

然而，随着GCaMP8的发展，从这些工具中获得的信息已经融合在一起。张和他的同事们通过对GCaMP8释放的光爆发的计算分析表明，他们的传感器可以像电压成像一样准确地检测动作电位^15，16．类似地，GCaMP8可以可靠地检测通常频繁放电的果蝇神经元何时变得短暂不活动，提供与基于gevi的测量相似的结果^17，18．

当电压成像和钙成像都可以同时用于记录许多神经元时，实际的实验考虑可能会说服未来的研究人员选择钙成像而不是电压成像。GCaMP8与现有的显微镜配置和制备方法兼容。该系列可用于在更大的范围内检查广泛的神经元网络的活动，而不是使用电压成像。有人可能会想象，GCaMP8系列将很快被用于解释详细的、以毫秒为单位的活动序列，这些活动在大脑特定区域的许多神经元中流动。

与这一代gcamp相关的快速动力学，以及现有的gvis，将促进快速光学显微镜和成像技术的发展。这样的显微镜将能够同时探测到许多神经元发出的瞬时光爆发。但就目前而言，钙传感器动力学不再是解释快速神经活动的瓶颈这一事实将受到许多神经科学家的欢迎。