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原位人体核孔复合物的结构分析

自然体积526，页面140 - 143 (2015）引用本文

主题

摘要

核孔复合物是所有真核细胞的基本组成部分，介导核质交换。确定它们110兆达尔顿的结构是一项艰巨的挑战原位结构生物学方法。在大约30个核孔蛋白(Nups)中，15个是有结构的并形成Y和内环复合物。这两个主要的支架模块在多个副本中组装成一个八倍旋转对称结构，融合内外核膜，形成一个直径约60纳米的中心通道1．支架上装饰有运输通道Nups，通常含有苯丙氨酸重复序列，并介导与货物复合物的相互作用。虽然Y综合体的部分建筑布局已经阐明，但尚不清楚它究竟是如何寡聚的原位．在这里，我们将冷冻电子断层扫描与质谱、生化分析、摄动实验和结构建模相结合，以生成迄今为止最全面的人类核孔复合体建筑模型。我们的数据表明，以前未知的蛋白质界面横跨Y复合体和内环复合体成员。我们发现传输通道Nup358(也称为Ranbp2)在y -络合物的寡聚过程中发挥了以前没有预料到的作用。我们的发现模糊了支架和转运通道Nups之间的既定界限。我们得出结论，与包被囊泡类似，同一结构构件的几个副本-尽管成分相同-参与不同的局部相互作用和构象集。

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图1:人体NPC的层析图。
图2:Nup358配合物稳定了CR。
图3:人类NPC的脚手架架构。

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    文章中科院谷歌学者

下载参考

确认

我们非常感谢W. Baumeister和J. Plitzko访问马克斯·普朗克生物化学研究所的电子显微镜设备。我们感谢F. Schur, K. Beck, J. Briggs, C. Sachse, E. Hurt和F. Melchior的批判性建议，以及A. Neal对手稿的批判性阅读。我们感谢EMBL的机械车间，电子显微镜和蛋白质组学核心设施，统计数据分析中心的支持，并感谢J. Krijgsveld, J. Kirkpatrick和B. Klaus。K.H.B.由瑞士国家科学基金会、欧洲分子生物学组织和玛丽·居里行动提供博士后奖学金。A.O.得到了亚历山大·冯·洪堡基金会和玛丽·居里行动的博士后奖学金的支持。A.L.D.由史蒂文斯理工学院罗伯特·克鲁克斯·斯坦利奖学金和国家老龄化研究所(NIA)资助1R21AG047433-01。玛丽·居里共同基金行动下的EMBL跨学科博士后项目支持。J.S.G.获得了史蒂文斯理工学院的点火资助计划和NIA资助1R21AG047433-01。M.B.感谢EMBL和欧洲研究理事会(309271-NPCAtlas)的资助。

作者信息

作者指出

  1. 本杰明Vollmer

    †现地址:牛津大学结构生物学学部牛津粒子成像中心，惠康基金会人类遗传学中心，牛津OX3 70亿，英国

  2. 亚历山大·冯·阿彭，简·科辛斯基和勒诺·斯帕克斯:这些作者对这项工作做出了同样的贡献。

作者及隶属关系

  1. 欧洲分子生物学实验室，结构和计算生物学单元，海德堡，69117，德国

    Alexander von Appen, Jan Kosinski, Lenore Sparks, Alessandro Ori, Marie-Therese Mackmull, Niccolo Banterle, Luca Parca, Panagiotis kast蒂斯，Katarzyna Buczak, Shyamal Mosalaganti, Wim Hagen, Amparo Andres-Pons, Edward A. Lemke, Peer Bork, Khanh Huy Bui和Martin Beck

  2. 史蒂文斯理工学院化学、化学生物学和生物医学工程系，美国新泽西州霍博肯河街507号，07030

    Amanda L. DiGuilio和Joseph S. Glavy

  3. 马克斯·普朗克学会Friedrich Miescher实验室，Spemannstrasse 39, Tübingen, 72076，德国

    本杰明·沃尔默和沃尔夫拉姆·安东宁

  4. 麦吉尔大学解剖与细胞生物学系，蒙特利尔，H3A 0C7，魁北克，加拿大

    Khanh Huy Bui

作者
  1. 亚历山大·冯·阿彭
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  2. Jan辛斯
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  3. 丽诺尔的火花
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  4. 亚历山德罗·奥利
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  5. Amanda L. DiGuilio
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  6. 本杰明Vollmer
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  7. marie - therese Mackmull
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  8. 尼科洛Banterle
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  9. 卢卡Parca
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  10. Panagiotis Kastritis
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  11. Katarzyna Buczak
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  12. Shyamal Mosalaganti
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  13. 维姆·哈根
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  14. 帕罗Andres-Pons
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  15. 爱德华·a·莱姆克
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  16. 博克同行
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  17. Wolfram安东尼
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  18. 约瑟夫·s·格拉维
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  19. Khanh Huy Bui
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  20. 马丁贝克
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贡献

a.v.a.， J.K.和W.A.设计并进行实验，分析数据并撰写手稿。a.v.a.， J.K.和P.K.担任模特。B.V。l ., A.O。A.L.D, M.-T.M, K.B, A.A.-P W.H。，N.B. and S.M. designed and performed experiments, and analysed data. L.P. analysed data and performed modelling. J.S.G., E.A.L. and P.B. designed experiments and oversaw the project. K.H.B. designed and performed experiments, analysed data, oversaw the project and wrote the manuscript. M.B. designed experiments, analysed data, oversaw the project and wrote the manuscript.

相应的作者

对应到Khanh Huy Bui或马丁贝克．

道德声明

相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的经济利益。

额外的信息

与此手稿相关的是电子显微镜数据库条目EMD-3103EMD -3104EMD -3105EMD -3106和EMD -3107和蛋白质数据库条目5 a9q．

扩展的数据图形和表格

扩展数据图1人体NPC层析图。

一个使用直接电子探测器(本研究)获得的人鼻咽癌层析结构的核浆轴、CR、IR和NR的正切片，与使用类似实验流程的传统探测器获得的结构进行比较(电子显微镜数据库登录号EMD-2444)。在这两种情况下，CR、IR和NR是独立对齐的。箭头表示在IR中被解析的跨膜域。b， CR、IR和NR区域的傅里叶壳层相关曲线。c，直方图对应于中所示的彩色编码局部分辨率图d这是用ResMap计算的41．d，在两个不同的等值面阈值处显示NR环的单个节段(在所有其他图中，节段与它们的前和/或后不对称单元一起显示)。用两个相邻非对称单元的Nup43 β-螺旋桨外区域(水平箭头)和Nup133中区域(垂直箭头)的冗余密度来指明方向。边缘分辨率的降低是由于在对齐和平均期间使用的掩模的边界，覆盖了大约1.5倍的非对称单元。

扩展数据图2 b因子校正。

将滤波后的x射线结构与用不同b因子校正的层析图进行比较，以选择合适的b因子。一个， Nup107-Nup96-Sec13的x射线结构(上)，滤波到23 Å(下)，与b因子校正的外顶点各区域(2000 - 9000 Å)相比2．b， b因子6000 - 8000 Å2最接近x射线结构的特征。层析成像图的三个区域在b因子为6000 Å处与各自的x射线结构叠加2相比之下，8000 Å2．在这些良好分辨的区域，额外的特征，如更详细的β-螺旋桨形状或Nup107手指结构域(参见图2a, b而且扩展数据图4e)的含量明显为8000 Å2．由于局部分辨率的偏差(扩展数据图1c, d)更保守的b因子为6000 Å2被选来校正平均值。星号表示可以明确定位但在方向上有一些不确定的结构，即Nup85羧基末端结构域(CTD)。c，将Nup107-Nup96-Sec13的x射线结构系统拟合到层析图中，如图扩展数据图7a而是在不同的b因子上。调整P数值按顺序显示;插图中用红色显示了四个真正的正面击球。后者始终被认为是最热门的，除非b因子为9000 Å2使用。

图3 Y复合体混合模型与顶点区域x射线结构的比较10．

左侧所示的Y复合体(NR)的混合模型是独立于右侧所示顶点的坐标x射线结构生成的。根据空间约束和互补信息，将Y复合体成员的结构拟合到层析图中补充表1详情)。外部和内部的Y复合体/顶点分别显示在顶部和底部。一个人体Y复合物的分子量约为1个MDa，其中大部分是结构化的。星号表示可以明确定位但在方向上有一些不确定性的结构。这些是Elys和Nup133以及Nup85-CTD的β-螺旋桨。

内部和外部的Y配合物具有不同的构象，并参与局部特定的相互作用集。

一个，从上面可以看到内、外Y配合物的排列。x射线结构被过滤到2.3 nm分辨率，并用蛋白质着色。指出了Y配合物之间五个界面的位置。b， Nup160的内拷贝和外拷贝相对于膜具有相同的法向量，由于与中轴的直径不同，它们彼此略有倾斜。cNup107 C端和n端结构域之间以及Nup133 C端结构域内的铰链在内部和外部Y配合物中具有不同的构象。在内杆的情况下，与x射线结构中揭示的结构相比，Nup133的中间区域略微向内弯曲，这可以通过引入铰链来解释，正如先前基于Nup133结构的预测37．d，显示五个界面细节(I-V)的放大视图。右边的面板表示观察点。(I)外顶点的Sec13与内顶点的Nup107 n端域交界4，10；(II)在两种Y配合物的情况下，Nup133的n端β-螺旋桨与后部不对称单元的Nup160界面，形成有利于环形成的头尾接触12，14；(III)因此，只有Nup133内拷贝的β-螺旋桨被夹在两个Nup160蛋白之间。在这种情况下，n端α-螺旋结构域与后对称单元的外层Nup160延伸成一个更大的界面;(IV)内Nup133的C端分支出内杆，与外杆上的对应端形成接触。这个相对较小的界面让人联想到在Nup133-Nup107结构中观察到的晶体接触(蛋白质数据库登录号3I4R)37；外顶点的(V) nup85和43与内杆的Nup107的c端畴形成接口。eNup107手指结构域(红色)是高等真核生物所特有的。当它的内拷贝(如图所示)与外顶点的Nup43和Nup85连接时，它的外拷贝与连接两个Y复合体的密度(图2a, b)．指域中的磷酸化位点被描绘为暗红色球体。星号表示可以明确定位但在方向上有一些不确定性的结构，即Nup85-CTD。f，从中心通道看CR的顶点区域。磷酸化位点表示为e．连接两个Y复合体的密度是分段的，如图2 b并且与Sec13、Nup96和Nup107的几个磷酸化位点密切接触。Seh1和Nup85的磷酸化位点直接靠近Nup214复合体区域。

扩展数据图5内、外Y复合体连接。

一个， CR中两个Y配合物的Nup96/107区域有四个钳形密度(红色部分)。只有内部的钳形连接两个Y配合物，而外部的钳形突起在CR的外部外围形成一个更复杂的子结构(图2 b)．b和在图2c, d但对于NR。c火山图可视化了Nup358敲除(处理)中HeLa细胞的鸟枪蛋白质组学数据，与对照条件进行了比较。d， NLS-MBP-GFP(即与gfp标记的麦芽糖结合蛋白结合的核定位序列)在未处理细胞和Nup358敲除条件下的核转运测定。如先前观察到的，在没有Nup358的情况下，进口具有经典核定位信号的货物42，但不能排除效率较低。e，击倒条件的亚层析图分类显示，约5%的不对称单元在CR中含有外层Y配合物，这与的击倒效率非常一致∼95%。分类是在非对称单位的水平上进行的。转移到npc水平，这表明在基因沉默条件下观察到的920个npc中，663个CR中没有外部Y复合物，183个有一个，49个有两个，14个有三个，4个有四个，6个有五个，0个有六个，1个有七个，0个有八个。f在击倒条件下，CR中观察到的外层Y配合物的邻接性远高于预期。在NPC水平上分析CR中含有外部Y配合物的5%的不对称单元，以确定其相邻的不对称单元在CR中是否也含有外部Y配合物。观察到的邻接频率以深蓝色显示。分别在CR中观察到的外层Y配合物的总数和具有相邻配合物的数量表示为(n/米)．观察到的频率大大高于理论频率(亮蓝色所示)，如果Y配合物与随机亚基结合，则理论频率将被预期。这一观察表明，在CR中Y配合物的组装/维护可能通过相邻Y配合物的头尾接触而产生。每个CR有0个、1个和8个外部Y复合物的npc没有显示出来，因为它们不包含任何相邻的Y复合物或没有被观察到。

图6内环支架Nups的结构特征以及Nup160和Nup133的膜结合基序。

一个，同图3而是为了CR。b，外Y配合物(橙色)和内Y配合物(灰色)的Nup160(左)符合NR。Elys的c端结构域的附加密度被指出。Nup133拟合显示在正常(中间)和高(右边)等值面阈值处。在较高的等值面阈值处，连接两个Nup133结构域的密度在外杆也很明显。膜结合母题43都是红色的。星号表示可以明确定位但在方向上有一些不确定性的结构。这些是Elys和Nup133以及Nup85-CTD的β-螺旋桨。

扩展数据图7所选NPC组分与电子显微镜图的系统拟合。

每个面板显示20个得分最高的拟合(左)，一个图P所有解的值(右)和插图中的顶部解。用于拟合的模型显示为带状表示。拟合和数据点根据相似的组进行着色P值范围。这群人最适合PValues被标上红色(高置信度匹配)，次优组(中等置信度匹配)被标上蓝色，其余的都被标上青色。为了清晰起见，膜密度已被去除。一个Sec13-Nup96-Nup107子复合体，其基础真相是已知的，因为它是顶点的一部分。b- - - - - -d，与一个而Nup155的n端结构域分别为Nup205/188- ntd的开放构象(模板Nup205)和Nup205/188- ntd的封闭构象(模板Nup188)。解id，解的单位。

扩展数据图8共洗脱分析检测弱核孔蛋白相互作用

为了检测支架核孔蛋白的弱相互作用，我们结合快速亲和分离凝胶过滤和定量靶向蛋白质组学来测量绝对蛋白质丰度。HEK293细胞表达各种亲和标记的Nups(与图3 c没有诺可达唑阻滞)被用温和的条件和超声溶解蛋白。亲和分离物进行凝胶过滤，所有组分都使用靶向质谱分析，如前所述24，26，以测量高分子量和低分子量部分的蛋白质丰度。高分子质量分数表明了大分子物种潜在的外向相互作用。低分子量部分将突出超声处理后出现的较小碎片。一个，在亲和标记的Nup85的情况下，最上面的面板显示了215 nm的凝胶过滤实验吸收曲线。中间的面板显示了所有分数中y复合体成员的任意蛋白质丰度单位(红色为Nup85，黑色为所有其他y复合体成员)。高分子部分(蓝色条)和低分子部分(绿色条)的蛋白质丰度(归一化到亲和标记蛋白质)在底部面板中以柱状图的形式显示。低分子峰对应于小臂蛋白(Nup85, Seh1和Nup43)，高分子峰对应于完整的Y复合体。b对Nup205、Nup93和Nup155进行了同样的处理。在高分子部分(蓝色条形图)和低分子部分(绿色条形图)显示了七个最丰富的共洗脱Nups。以Nup85(上)为例，除了y复合体成员外，显示了7个最丰富的蛋白质。y -络合物成员与Nup205和Nup93的弱相互作用明显。在Nup155的情况下，检测到与CR和NR元件之间的弱相互作用，以及在IR与CR/NR连接的密度中，定位于Nup155 c端结构域附近的Sec13。Tpr被排除在分析之外，因为它存在于所有馏分中。基于单个参考肽的蛋白质丰度用星号标记。c，同一个(上图)，但从诺可达唑阻滞细胞纯化的Nup188亲和性。d，同图3 c但从诺可达唑阻滞细胞纯化的Nup188亲和力。高分子量部分的共洗脱物与亲和纯化Nup62中观察到的共洗脱物相似(图3 c)．检测到Nup188、Nup98、Nup93、Nup62等化学计量量，Nup214、Nup88和ra1富集。因此，Nup188-Nup93异源二聚体与CR中已确定的组分Nups结合，这与系统拟合方法一致。e，同c但是对应于图3 c．f，同b(第二组为Nup205)，但为诺可达唑阻滞细胞。在Nup205的情况下，与未处理的细胞相比，诺可达唑被捕的共纯化物种相似。

扩展数据表1用于同源建模的模板结构或选定的人体晶体结构
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y配合物的结构分析原位

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冯·阿彭，A.科辛斯基，J.斯帕克斯，L.et al。原位人体核孔复合物的结构分析。自然526， 140-143(2015)。https://doi.org/10.1038/nature15381

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