摘要gydF4y2Ba
在真核生物中，精确的染色体分离在有丝分裂和减数分裂维持基因组的稳定性和防止非整倍体。着丝粒是一种大型蛋白质复合物，通过组装到专门的Cenp-A核小体上gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，功能连接着丝粒染色质和有丝分裂纺锤体的微管gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．脊椎动物染色体的着丝粒由数百万个DNA碱基对组成，并连接到多个微管上，而出芽酵母的简单点着丝粒连接到单个微管上gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba．所有16个出芽酵母染色体使用一个Cenp-A核小体(Cenp-A)组装完整的着丝粒gydF4y2BaNucgydF4y2Ba)，每一个都完美地位于同源着丝粒上gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．内部和外部的着丝点模块分别负责与着丝粒染色质和微管的相互作用。在这里，我们描述的冷冻电子显微镜结构gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba内着丝粒模块，构成性着丝粒相关网络(CCAN)复合体，组装到Cenp-A核小体(CCAN - Cenp-A)上gydF4y2BaNucgydF4y2Ba)．该结构解释了CCAN的组成亚复合物的相互依赖性，并显示了CCAN的y型开口如何容纳Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba使特定的CCAN亚基与核小体DNA和组蛋白亚基接触。与Cenp-A两端未包裹DNA双工的相互作用gydF4y2BaNucgydF4y2Ba主要由Cenp-L-Cenp-N亚复合体中的dna结合槽介导。破坏这些相互作用会损害CCAN在Cenp-A上的组装gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．我们的数据表明了CCAN识别Cenp-A核小体的机制，以及CCAN如何作为外着丝粒组装的平台，将着丝粒连接到有丝分裂纺锤体，以进行染色体分离。gydF4y2Ba
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这项工作由MRC拨款(MC_UP_1201/6)和CRUK拨款(C576/A14109)资助给D.B，地平线2020计划INFRAIA项目Epic-XS (project 823839)资助给A.J.R.H.，德意志Forschungsgemeinschaft (EH237/12-1)资助给a.e.e.m。我们感谢LMB、eBIC、剑桥大学和利兹电子显微镜设备在电子显微镜数据收集方面的帮助，感谢S. Scheres在电子显微镜处理方面的帮助，感谢Barford小组的成员进行了有益的讨论，感谢J. Grimmett和T. Darling在计算方面的帮助，感谢J. Shi在昆虫细胞表达方面的帮助。gydF4y2Ba
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自然gydF4y2Ba感谢Eva Nogales和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。gydF4y2Ba
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z.z克隆的着丝点和核小体结构。J.Y.和Z.Z.纯化蛋白，进行蛋白复合物重建和生化遗传分析。K.Y.和L.C.制备了低温em网格，收集和分析了电子显微镜数据，并确定了CCAN−Cenp-A的三维重建gydF4y2BaNucgydF4y2Ba和免费的Cenp-HIK。D.B.和K.Y.拟合坐标并建立模型，J.Y.和S.H.M.进行SEC-MALS和分析超离心。D.F.收集并分析了XL-MS数据。A.J.R.H.指导了XL-MS实验和分析。A.E.E.-M。生成了gydF4y2Bachl4Δcse4-R37AgydF4y2Ba而且gydF4y2Bachl4ΔgydF4y2Ba酵母菌株。D.B.指导了这个项目。K.Y.和D.B.在所有作者的帮助下完成了手稿。gydF4y2Ba
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出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba
扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba
扩展数据图1重构gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复合物。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， (i) CCAN， (ii) CCAN - Cenp-A核小体(Widom 601)配合物，(iii) Cenp-A核小体(Widom 601)， (iv) H3核小体(Widom 601)和(v) H3的尺寸排除色谱谱(Agilent Bio SEC-5柱)gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba(与widom601)。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CCAN-Cenp-A的比较尺寸排除色谱剖面(Agilent Bio SEC-5柱)gydF4y2BaNucgydF4y2BaCenp-A核小体包裹有(i) 147 bp的Widom 601定位序列(CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba(Widom 601)gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)或(ii) 153bpgydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba着丝粒gydF4y2BaCen3gydF4y2Ba序列(CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba（gydF4y2BaCen3gydF4y2Ba))。两种配合物以相同的体积洗脱。CCAN和H3核小体不形成复合物(iii)。gydF4y2BacgydF4y2Ba14亚基CCAN复合物的考马斯蓝染色SDS-PAGE。gydF4y2BadgydF4y2Ba， Cenp-A考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶gydF4y2BaNucgydF4y2Ba(601年Widom教授)。Lane E32，分数32的溴化乙锭染色凝胶。gydF4y2BaegydF4y2Ba, CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba(widom601)复杂。Lane E13，溴化乙锭染色凝胶，分数13。尺寸排除色谱图示于gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．gydF4y2BafgydF4y2Ba， CCAN和H3核小体SDS-PAGE凝胶(Widom 601) SEC运行如图所示gydF4y2BabgydF4y2Ba．gydF4y2BaggydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba，考马斯蓝染色SDS-PAGE凝胶与Cenp-TW共表达，并在标记的Cenp-I亚基(*)上用双链标记纯化。gydF4y2BajgydF4y2Ba， Cenp-TW (Cenp-TgydF4y2BaHFDgydF4y2BaW)与Cenp-HIK交互gydF4y2Ba头gydF4y2Ba．这些结果证实了我们的低温电镜图中Cenp-H, K和I亚基的分配。gydF4y2BakgydF4y2Ba， CCAN-Cenp-A的组织示意图gydF4y2BaNucgydF4y2Ba亚基和亚复合物以及与外着丝粒Mis12和Ndc80复合物的连接。线表示亚复杂连接。连接Cenp-A的两条通路gydF4y2BaNucgydF4y2Ba连接到Ndc80复合体和微管的蛋白分别为P1和P2(粗线连接到Ndc80)。必需P1通路的亚基标记为黑色，并用蓝色阴影表示，而非必需P2通路的亚基标记为白色，并用黄色阴影表示。当P1通路因Dsn1磷酸化缺陷而出现缺陷时，P2通路就变得必不可少gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．在gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BajgydF4y2Ba分别进行了三次独立试验，结果相似。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图2gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复杂。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， CCAN-Cenp-A的典型冷冻电子显微照片gydF4y2BaNucgydF4y2Ba，代表9,002张显微照片。gydF4y2BabgydF4y2Ba， CCAN二维类图库，代表100个二维类。gydF4y2BacgydF4y2Ba， CCAN-Cenp-A的2D类图库gydF4y2BaNucgydF4y2Ba，代表150个2D类。c2对称(CCAN)的2D类平均gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba在c2 -对称轴平面上观察的复合物用红色标出。只有少数视图被观察到，排除了3D重建。低温电镜网格部分破坏了CCAN-Cenp-A的稳定gydF4y2BaNucgydF4y2Ba相互作用，导致(CCAN)的丰度非常低gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba颗粒(约占总量的0.03%)。(CCAN)的双对称轴gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复合体显示为虚线箭头。数据的实验gydF4y2BabgydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba独立试验12次，结果相似。gydF4y2BadgydF4y2Ba， CCAN-Cenp-A的冷冻电镜重建FSC曲线gydF4y2BaNucgydF4y2Ba复合物:apo-CCAN, mask1 (Cenp-OPQU+， Cenp-LN)， mask2 (Cenp-HIK, Cenp-LN, sub-Cenp-OP)， CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba．中定义了用于MBR的Mask1和mask2gydF4y2BahgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba我gydF4y2Ba和方法。gydF4y2BaegydF4y2Ba， CCAN-Cenp-A的Angular分布图gydF4y2BaNucgydF4y2Ba粒子。gydF4y2BafgydF4y2Ba， CCAN的局部分辨率图。gydF4y2BaggydF4y2Ba， CCAN-Cenp-A的局部分辨率图gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．gydF4y2BahgydF4y2Ba， mask1的局部分辨率图(Cenp-OPQU+， Cenp-LN)。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， mask2的局部分辨率图(Cenp-HIK, Cenp-LN, sub-Cenp-OP)。gydF4y2Ba
图3 CCAN-Cenp-A三维分类工作流程gydF4y2BaNucgydF4y2Ba低温电子显微镜数据集。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba在最初的2D分类后，约140万个粒子被3D分类为apo-CCAN(52%)和CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复杂的(48%)。对于apo-CCAN, 4%以二聚体形式存在(黑箱)，19%显示有序头基(Cenp-HIK)gydF4y2Ba头gydF4y2Ba)为Cenp-HIK-TW亚复合体(蓝框)。在CCAN-Cenp-A上应用掩码gydF4y2BaNucgydF4y2Ba低温电镜图以排除结构变量Cenp-HIKgydF4y2Ba头gydF4y2Ba域用于重建4.15 Å结构。gydF4y2BabgydF4y2Ba， MBR使用的四种掩模的详细信息。gydF4y2BacgydF4y2Ba，一个小型的3D类CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba，揭示了附着在Cenp-HIK上的密度gydF4y2Ba头gydF4y2Ba与Cenp-A的DNA环流接触gydF4y2BaNucgydF4y2Ba被分配为Cenp-TgydF4y2BaHFDgydF4y2BaW。gydF4y2Ba
图4 apo-CCAN的低温电镜密度图。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， Cenp-H和Cenp-K卷曲线圈的部分冷冻- em图。中定义的高度保守的亚基间残基的选择gydF4y2BabgydF4y2Ba而且gydF4y2BacgydF4y2Ba贴上标签。这些残基在低温电镜密度中被很好地定义，与结构一致。gydF4y2BabgydF4y2Ba，gydF4y2BacgydF4y2Ba， Cenp-H卷曲线圈区域的多序列比对(gydF4y2BabgydF4y2Ba)及Cenp-K (gydF4y2BacgydF4y2Ba)．gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BafgydF4y2Ba， Cenp-LN部分低温电磁图(gydF4y2BadgydF4y2Ba)、Cenp-I (gydF4y2BaegydF4y2Ba)和Nkp1-Nkp2 (gydF4y2BafgydF4y2Ba)．该结构中Cenp-H、Cenp-I和Cenp-K的链位和极性与酵母Ctf3 (PDB: 6OUA)的冷冻电镜结构一致。gydF4y2Ba61gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图5 CCAN和CCAN - cenp - a的Cryo-EM密度gydF4y2BaNucgydF4y2Ba复合物。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba， CCAN-Cenp-A的低温电镜重建gydF4y2BaNucgydF4y2Ba从未交联的样本，在8.6 Å分辨率。gydF4y2BabgydF4y2Ba，二聚体CCAN的Cryo-EM图(也扩展数据图)。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba，黑匣子)。如图所示，子单元用颜色编码。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．3.5 Å单体自由CCAN坐标被刚体对接到冷冻em地图中。gydF4y2BacgydF4y2Ba，卡通代表的gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba思想复杂gydF4y2Ba15gydF4y2Ba(右)，显示出与CENP-OPQU+(左)的Cenp-QU-Nkp1-Nkp2的卷曲线圈显著相似。gydF4y2BadgydF4y2Ba，免费Cenp-HIK的4.7 Å分辨率冷冻- em地图，并配有CCAN的拟合坐标。gydF4y2BaegydF4y2Ba，在CCAN的背景下，Cenp-HIKgydF4y2Ba头gydF4y2Ba旋转以适应Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba．Cenp-HIK的两种构象来自apo-CCAN和CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba在Cenp-HIK的刚性部分上叠加配合物(apo-CCAN显示Cenp-I的c端区域)，表明Cenp-HIK构象的可变性gydF4y2Ba头gydF4y2Ba在两个州之间。Cenp-HIK的亚基gydF4y2Ba头gydF4y2Ba的CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba都是浅色的。gydF4y2BafgydF4y2Ba， Cenp-A的Cryo-EM密度gydF4y2BaNucgydF4y2Ba显示了Cenp-C的Cenp-C基序。gydF4y2Ba
图6 CCAN和CCAN - cenp - a的XL-MS分析gydF4y2BaNucgydF4y2Ba复合物。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba，圆形图显示所有已识别的CCAN交联(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)和CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba（gydF4y2BabgydF4y2Ba)．亚基间和亚基内交联分别用红色和蓝色表示gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba，直方图显示C .gydF4y2BaαgydF4y2Ba- cgydF4y2BaαgydF4y2Ba可映射到CCAN上的交联的距离分布(gydF4y2BacgydF4y2Ba)和CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba结构(gydF4y2BadgydF4y2Ba)．95%的映射交联满足交联器施加的距离限制30 Å，用红色虚线表示。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，映射到CCAN的交联(gydF4y2BaegydF4y2Ba)和CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复杂(gydF4y2BafgydF4y2Ba)．亚基间和亚基内交联分别用红色和蓝色表示。超过交联器施加的距离限制30 Å的交联以黄色表示。gydF4y2BaggydF4y2Ba，在CCAN结构上通过XL-MS显示与Cenp-C交联的残基。红色球体，CCAN-Cenp-A的交联gydF4y2BaNucgydF4y2Ba复杂;黄色球体，apo-CCAN特有的额外交联。在gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba分别进行了三次独立试验，结果相似。gydF4y2Ba
扩展数据图7gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba核小体被打开。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba， Cenp-LN亚复合物dna结合槽的正电荷静电势守恒gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba，gydF4y2Ba美国非洲酒gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba．gydF4y2Ba美国非洲酒gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba智人gydF4y2Ba由建模结构表示。gydF4y2BadgydF4y2Ba， Cenp-N与之相互作用gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba在CCAN的背景下，不同于自由人类Cenp-N与Cenp-A的相互作用gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．人Cenp-N - cenp - a核小体结构的Cenp-N亚基(PDB: 6C0WgydF4y2Ba29gydF4y2Ba的Cenp-N上gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba结构。在Cenp-N-Cenp-A模式下gydF4y2BaNucgydF4y2Ba交互,Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba会与CCAN的Cenp-OPQU+和Cenp-N发生冲突。gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba，结构gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaH3gydF4y2BaNucgydF4y2Baid3 (PDB: 1gydF4y2Ba24gydF4y2Ba) （gydF4y2BaegydF4y2Ba)和Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba（gydF4y2BafgydF4y2Ba，这工作)。gydF4y2BaggydF4y2Ba的n端区域序列对齐gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaH3和Cenp-A (Cse4)组蛋白。对于嵌合物H3gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba，残差1-50gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaH3取代了1-140的残基gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCenp-A。类似的方法被用于脊椎动物Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
扩展数据图8 CCAN SDS-PAGEgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复合物。gydF4y2Ba
对应的排除尺寸色谱图如图所示。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba突变Cenp-N dna结合槽不会损害CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba组装。gydF4y2BacgydF4y2Ba，野生型CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba与Cenp-A形成复合体gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba突变Cenp-N dna结合槽可破坏CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba交互。gydF4y2BaegydF4y2BaCenp-A L1环的突变并没有使CCAN失稳gydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba交互。gydF4y2BafgydF4y2Ba， Cenp-A N端缺失(1-129)(gydF4y2BaΔNgydF4y2BaCenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba)不损害CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba交互。gydF4y2BahgydF4y2Ba，都是CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba和CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba-Cenp-NgydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Ba与H3结合不良gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba．所显示的实验是独立进行的，重复三次，结果相似。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图9 CCAN测试gydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba与Cenp-A结合gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba，野生型CCAN的比较SEC剖面(Agilent Bio SEC-5列)gydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba和Cenp-NgydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Ba的CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba对Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba及其修饰物(Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Bal1gydF4y2BaNucgydF4y2Ba，gydF4y2BaΔNgydF4y2BaCenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba和H3gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba)及H3gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．L1环突变(Cenp-AgydF4y2BaL1gydF4y2Ba-gydF4y2BaNucgydF4y2Ba)或删除n端129残基(gydF4y2BaΔNgydF4y2BaCenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba)并没有破坏CCAN的稳定gydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba交互。相比之下，CCAN与Cenp-NgydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Ba结合不太好和CCAN和CCAN - cenp - ngydF4y2Ba无足轻重的人gydF4y2Ba几乎不与H3结合gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba．(CCANgydF4y2BaΔCgydF4y2Ba, CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba)．相关的SDS-PAGE见扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba)．gydF4y2BabgydF4y2Ba，考马斯蓝染色SDS-PAGE显示CCANgydF4y2BaΔCenp-CgydF4y2Ba与H3无关gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba，微球菌核酸酶消化Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba, H3gydF4y2BaNucgydF4y2Ba和H3gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba．widom601 DNA显示为对照。H3的gydF4y2BaNucgydF4y2Ba和H3gydF4y2BaNgydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba与Cenp-A相比，其保护的DNA长度相似且更长gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2BaCBF3型号gydF4y2Ba60gydF4y2Ba与CCAN-Cenp-A结合gydF4y2BaNucgydF4y2Ba，表明CBF3不会与完全组装的着丝点相关联，这与蛋白质组学数据一致gydF4y2Ba62gydF4y2Ba．在gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba分别进行了三次独立试验，结果相似。凝胶源数据参见补充图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
扩展数据图10gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba在溶液中包含两个CCAN配合物。gydF4y2Ba
一个gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BacgydF4y2Ba， (CCAN)的预测质量gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba为1.31 MDa， (CCAN)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2BaMDa为0.77,CCAN二聚体MDa为1.09(扩展数据表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．交联的代表性SEC-MALS数据gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复杂(gydF4y2Ba一)gydF4y2Ba，结果相似，平均分子质量为1.23 MDa ((CCAN)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba）;uncrosslinkedgydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复杂(gydF4y2BabgydF4y2Ba)，独立进行三次试验，结果相似，平均MDa质量为1.38 ((CCAN)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba)和526 kDa (CCAN);而且gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba单独CCAN (gydF4y2BacgydF4y2Ba)，结果相似，前缘(绿色)平均质量为839 kDa，后缘(洋红色)平均质量为650 kDa，表明存在未分解的单体-二聚体平衡。gydF4y2BadgydF4y2Ba，gydF4y2BaegydF4y2Ba、交联的速度分析超离心(gydF4y2BadgydF4y2Ba)和非交联(gydF4y2BaegydF4y2Ba）gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2BaCCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba所示配合的残差复合体gydF4y2BafgydF4y2Ba而且gydF4y2BaggydF4y2Ba．gydF4y2BafgydF4y2Ba，gydF4y2BaggydF4y2Ba，适合gydF4y2BacgydF4y2Ba（gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba)交联复合体(gydF4y2BafgydF4y2Ba)，主要沉积物种类位于15.8S (gydF4y2Ba年代gydF4y2Baw, 20gydF4y2Ba= 26.1S)，次要种为12.1S (gydF4y2Ba年代gydF4y2Baw, 20gydF4y2Ba= 20.0S)，对应的计算质量为1.34 MDa ((CCAN)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba)和896 kDa(可能(CCAN)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba)，摩擦比拟合值为1.761。gydF4y2BaggydF4y2Ba，对于未交联的样品，主要种分解为两个种，沉积时间为14.3S (gydF4y2Ba年代gydF4y2Baw, 20gydF4y2Ba= 22.6S)及15.7S (gydF4y2Ba年代gydF4y2Baw, 20gydF4y2Ba= 24.9S)，次要种为12.3S (gydF4y2Ba年代gydF4y2Baw, 20gydF4y2Ba= 19.4 S)，其质量为1.32 MDa ((CCAN)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba)和1.15 MDa ((CCAN)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)及716 kDa ((CCAN)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba)。在gydF4y2BadgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2BaggydF4y2Ba分别进行了三次独立试验，结果相似。gydF4y2BahgydF4y2Ba，两个2D类平均值的例子，显示(CCAN)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba在C2对称轴平面上观察的粒子(红色轮廓)(数据来自扩展数据图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)和模型的二维重投影(CCAN)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba基于CCAN-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba低温电镜重建(黄色轮廓)(如图所示gydF4y2Ba我)gydF4y2Ba．计算的重投影与观测到的二维类在形状和尺寸上有密切的对应关系。(CCAN)的双对称轴gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba复合体显示为虚线箭头。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba关于CCAN如何组装到Cenp-A核小体上将与外着丝体-微管界面相互作用的两种替代模型(补充视频)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba在场景(1)中，CCAN与外着丝粒从与dna结合面同一侧相互作用。附着在外着丝粒上的微管将从上面的核小体和伸展的DNA下面升起CCAN。gydF4y2BajgydF4y2Ba在场景(2)中，微管-外着丝点界面从相对的一侧接触到CCAN dna结合表面。着丝点外(outer-KT): KMN网络和微管附着复合物，Dam1-DASH(出芽酵母)和脊椎动物的Ska蛋白。(CCAN)的组合维数gydF4y2Ba2gydF4y2Ba-Cenp-AgydF4y2BaNucgydF4y2Ba(32纳米)与酵母着丝粒中心的轮毂相匹配gydF4y2Ba63gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
补充信息gydF4y2Ba
补充图1gydF4y2Ba
电泳分离得到的所有数据的原始源图像:考马斯蓝染色和溴化乙锭染色的SDS PAGE和western blots染色和溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶gydF4y2Ba
补充表1gydF4y2Ba
载脂蛋白CCAN交联质谱数据。列出了交联赖氨酸残基gydF4y2Ba
补充表2gydF4y2Ba
CCAN-Cenp-A的交联质谱数据gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．列出了交联赖氨酸残基gydF4y2Ba
视频1gydF4y2Ba
CCAN-Cenp-A的低温电镜密度图gydF4y2BaNucgydF4y2Ba如图所示，首先没有密度Cenp-HIKgydF4y2Ba头gydF4y2Ba．接下来，CCAN-Cenp-A的密度图gydF4y2BaNucgydF4y2Ba与Cenp-HIKgydF4y2Ba头gydF4y2Ba显示的是gydF4y2Ba
视频2gydF4y2Ba
二聚体CCAN在Cenp-A上组装的模型gydF4y2BaNucgydF4y2Ba．CCAN-Cenp-A的两种情况gydF4y2BaNucgydF4y2Ba表示可能附着在外层着丝点上(扩展数据图10i, j)gydF4y2Ba
权利和权限gydF4y2Ba
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严K，杨J，张Z。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba内着丝粒CCAN复合物组装到着丝粒核小体上的结构。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba574gydF4y2Ba， 278-282(2019)。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1609-1gydF4y2Ba
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组装到DNA上的人类CCAN复合物的结构洞见gydF4y2Ba
细胞的发现gydF4y2Ba(2022)gydF4y2Ba
CENP-N促进着丝粒染色质的压实gydF4y2Ba
结构与分子生物学gydF4y2Ba(2022)gydF4y2Ba
哺乳动物PA28αβ- icp免疫蛋白酶体的低温电镜显示了PA28αβ激活蛋白酶体的独特机制gydF4y2Ba
自然通讯gydF4y2Ba(2021)gydF4y2Ba
出芽酵母基因组的高分辨率蛋白质结构gydF4y2Ba
自然gydF4y2Ba(2021)gydF4y2Ba
布里金连接着外着丝点和着丝粒染色质gydF4y2Ba
自然通讯gydF4y2Ba(2021)gydF4y2Ba
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