摘要
爆炸真菌Magnaporthe oryzae通过一种叫做附着胞的特殊的产生压力的感染细胞进入寄主植物，附着胞在物理上破坏叶片角质层1，2．胀气是一种巨大的侵袭力，通过间隔蛋白介导的细胞骨架重组和肌动蛋白依赖的刚性穿透菌丝的突出3.．然而，在附着胞介导的植物侵染过程中调节胀压产生的分子机制仍然知之甚少。在这里，我们展示了一种肿胀敏感的组氨酸-天冬氨酸激酶Sln1，使附着胞在达到一个关键的肿胀阈值时能够感知，从而促进宿主渗透。我们发现Sln1传感器以压力依赖的方式定位于附着胞孔，这与植物侵染数学模型的预测一致。一个Δsln1突变体产生过量的细胞内附着胞膨胀，产生高度黑化的无功能附着胞，并且不组织叶片感染所需的萼片和极性决定因子。Sln1与蛋白激酶C细胞完整性通路并行作用，作为蛋白激酶a camp依赖性信号传导的调节剂。Pkc1磷酸化NADPH氧化酶调节剂NoxR，这些信号传导通路共同调节附着胞膨胀并触发侵袭力的产生，导致blast疾病。
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致谢
我们感谢O. Goode和T. Penn的技术支持。本研究由欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)下的欧洲研究委员会(ERC)高级研究员奖资助，ERC批准号:294702 GENBLAST。L.S.R.感谢已故的P. Ryder先生的支持和鼓励。
作者信息
作者及单位
贡献
l.s.r.、Y.F.D.和N.J.T.构思并设计了这个项目。L.s.r, y.f.d.， m.j.k, m.o.r。, N.C.-M。和小杨进行了实验工作。dms进行了生物信息学分析。c.v.， A.M.和V.S.进行了数学建模。F.L.H.M N.C.-M。J.S.进行了蛋白质组学分析。L.S.R.和N.J.T.在合著者的帮助和投入下完成了这篇论文。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
作者声明没有利益冲突。
额外的信息
出版商的注意b施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构的管辖权要求保持中立。
同行评议信息自然感谢Antonio Di Pietro、Nicholas Money和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。
扩展数据图和表
图1:在完整的水稻叶片上施用甘油不会导致细胞坍塌。
一个显微镜照片显示表达质膜标记Lti6B-GFP的转基因水稻系的表皮条，用水或甘油(5 M)处理24小时。甘油处理导致细胞崩溃。b用30 μl滴水或5 M甘油接种2周龄Lti6B-GFP转基因水稻的完整叶片，培养3 d。未观察到质解;也就是说，甘油不能导致整个植物细胞的崩溃。c，水稻植株用水或5m甘油喷雾处理，孵育5天(n= 3个独立重复实验)。甘油对水稻植株的健康没有任何影响，也没有引起任何萎蔫——这证实了完整叶片上的水稻细胞没有发生质解(见b）.显微照片代表了实验的两个独立重复。比例尺，20 μm (一个）;5 μm (b）.
图2人工降低肿胀或抑制黑色素生物合成会损害Septin的组织。
一个，经1.5 M甘油或100µM三环唑处理后具有完整隔素环的附着胞百分比。治疗在0 - 20 hp / i之间进行，并在24 hp / i时进行量化。因此，可以定义达到附着膜膨胀阈值(16-20 hp / i)和完成黑色素化(12 hp / i)的效果窗口n= 3个独立的生物重复;每个重复计数100个附着子。* * * *P< 0.0001, * * *P< 0.001， **P< 0.01(双尾未配对学生)t(与未治疗的对照组相比)。b在野生型Guy11和缺乏黑色素的突变体中具有完整的septin GTPase和F-actin环的载子百分比Δalb1,Δrsy1和Δ来数据为平均值±标准差n= 3个独立的生物重复;每个重复计数100个附着子。
图3 Sln1肿感激酶的特征。
一个附属体函数数学模型的图形化仿真m . oryzae．该模型假设septin通过种子环结构被募集到附着胞孔，从而允许募集f -肌动蛋白。黑色素被吸收到附着胞顶，与肿胀成比例，并被排除在毛孔之外。膨胀传感器(TS)被招募到毛孔中，调节黑化和膨胀的产生，同时积极调节septin的募集和F-actin的重组;这导致角质层破裂(补充视频)1）.b缺少充盈传感器的突变体产生过量的附着胞充盈，向细胞壁招募更多的黑色素，并阻止septin和F-actin向孔招募;因此，角质层不会被破坏(补充视频)2）.c，显微照片显示Δsln1突变体在36hp后不能入侵和定植水稻组织。在接种Δ的水稻细胞内未观察到侵染菌丝sln1．图像代表了n= 2个独立的生物重复。比例尺，10µm。d， Sln1-GFP在分生孢子和附着胞中的定位m . oryzae．分生孢子采自m . oryzae表达Sln1-GFP基因融合的Guy11转化，并接种在玻璃盖上。在0、4、6、8和24 hp / pi下拍摄图像。显微照片代表了Sln1-GFP在指定时间点的分布n= 3个独立的生物重复实验。比例尺，10µm。e，荧光显微照片显示，在24 hp / pi时，H1-GFP在附着胞内的细胞分布不受以1.5 M甘油(5 hp / pi)暴露于附着胞的影响n= 3个独立的生物重复;每个重复计数50个附着子。比例尺，10µm。
图4暴露于高渗应激后，附着胞中黑色素的沉积以剂量依赖的方式增加。
从gu11菌株中收集分生孢子，接种于玻璃罩上。将不同浓度的甘油溶液(0.25 - 2.5 M)在3-4 hp .i下施加，在24 hp .i下用明场显微镜对附着胞进行成像，观察附着胞中的黑色素层。通过施加高渗胁迫人为地降低肿胀导致附着胞持续的黑化，这与黑色素的生物合成和细胞壁沉积是肿胀依赖的一致。图像代表了n= 2个独立的生物重复实验。比例尺，10µm。
图5.扩展数据黑色素生物合成和细胞骨架组织受到Δ的影响sln1突变体。
一个， Δ中参与dnn -黑色素生物合成的基因转录丰度sln1基因表达量表示为基平均表达量，来自n= 3次RNA-seq实验。* * * *P< 0.0001(双尾未配对学生)t以及)。bSln1是septin介导的附着胞孔F-actin重组所必需的。从表达Septin3-GFP、Septin5-GFP、LifeAct-RFP、gelsolin-GFP、Chm1-GFP和Tea1-GFP基因融合的Guy11转化子中收集分生孢子，接种于玻璃罩上，在24 hp .i的条件下用荧光显微镜观察。记录完整环的附着胞比例。数据为平均值±标准差n= 3个独立的生物重复;每个重复计数50个附着子。* * * *P< 0.0001， **P< 0.01(双尾未配对学生)t以及)。c在黑色素缺乏的情况下，gfp不会被招募到附着胞孔Δalb1突变体。从Guy11和Δ采集分生孢子alb1将表达Sep5-GFP的转化子接种于玻璃罩上，在6、8和20 hp / pi下用荧光显微镜观察，记录Sep5-GFP在细胞皮层或附着胞孔的分布。图像代表了n= 3个独立的生物重复。比例尺，10µm。
机械敏感离子通道是附着胞形成所必需的，但对于septin介导的细胞骨架重组是必不可少的。
一个从Guy11中收集分生孢子，在钆(Gd)存在和不存在的情况下接种于玻璃盖上+3.）.在24 hp / pi下用明光场显微镜对附着胞进行成像。添加钆破坏附着胞的形成。图像代表了n= 3个独立的生物重复实验。b显微照片显示在0-20 mph下钆或维拉帕米处理后，Sep5-GFP在Guy11附着胞孔的细胞定位，在24 mph下成像n= 3个独立的生物重复。比例尺，10 μm (一个，b）.c，经钆和维拉帕米治疗后具有完整隔素环的附着胞百分比。数据为平均值±标准差n= 3个独立的生物重复;每个重复计数100个附着子。**P< 0.01(双尾未配对学生)t以及)。
图7机械敏感离子通道在致病性中是不可缺少的。
一个分裂标记方法的示意图，该方法用于产生编码机械敏感离子通道的基因的靶向缺失，LF表示左侧，RF表示右侧，作为目标基因开放阅读框两侧的区域。引物见补充表1．缺失突变体通过Southern blot分析(Δ凝胶源数据)鉴定mic1,Δmic2和Δmic3Southern印迹基因缺失酶切图见补充图。1a b和c分别)。b点图显示每个菌株收获的每片叶子在5厘米范围内观察到的病变频率(每个菌株收获60片叶子)。数据是指的平均值和单个数据点n= 2个独立的生物重复。每个数据点代表一个受感染水稻叶片上的病变数量。P> 0.01(双尾，未配对学生t(与对照组相比，采用韦尔奇校正测试)。c显微镜照片显示Mic2-GFP在Guy11和Δ的附着胞孔的细胞定位sln1在24hpi .图像是代表n= 3个独立的生物重复。标尺，10 μm。
扩展数据图8附着胞细胞壁的几丁质沉积在Δ中受损sln1突变体。
一个分别从Guy11和Δ采集分生孢子sln1突变体和接种在玻璃盖上形成附着胞。在24 hp .i时，用50µM calcolo - fluicwhite在黑暗中染色5分钟，清洗后用荧光显微镜捕获图像。线扫描图表示单个附着胞横切面上的钙荧光白色荧光。图像代表了n= 3个独立的生物重复。比例尺，10µm。b在酵母双杂交实验中，Sln1激酶与Sum1、Pkc1和Mps1相互作用。将pGAD-Sln1(猎物载体)与pGBK-Mps1、pGBK-PKC和pGBK-Sum1(诱饵载体)以及pGBKT7-53和pGADT7-T(阳性对照载体)同时共转化到Y2H Gold菌株中，激活了三个报告基因，并在中等强度培养基(−Ade、−Leu、-Trp、+X-α-gal)上生长。共变换也激活了的表达MEL1，导致培养基中α-半乳糖苷酶的分泌和X-α-半乳糖的水解，使酵母菌落呈蓝色。图像代表了n= 2次生物重复实验。
图9 PKA抑制剂H-89破坏凝胶环组装。
一个显微照片显示PKA抑制剂H-89在6和8 hp - pi下处理后，凝胶- gfp在Guy11附着胞孔的细胞定位，在24 hp - pi下成像n= 3个独立的生物重复实验。标尺，10 μm。bH-89处理后附着胞凝胶环完整的百分率。数据为平均值±标准差n= 3个独立的生物重复;每个重复计数50个附着子。* * * *P< 0.0001(双尾未配对学生)t以及)。c在Guy11和Δ中具有完整凝胶和间隔环的附着胞百分比cpka突变体。在Δ中，环通常更小cpka与Guy11相比，表明Δ的附着胞直径减小cpka突变体。数据为平均值±标准差n= 3个独立的生物重复;每个重复计数50个附着子。* * * *P< 0.0001(双尾未配对学生)t以及)。
图10细胞完整性与camp依赖性蛋白激酶A途径在稻瘟病菌胀感中的相互作用。
一个1NA-PP1对Pkc1活性的抑制可以逆转以恢复septin和gelsolin环的形成。显微照片显示，Pkc1在10 mph时阻断并在13 mph时释放后，Sep5-GFP和gelsolin-GFP在附着胞孔的细胞定位。附着胞在24 mph时成像n实验重复2次。b，热图显示的表达式NOX1，NOX2和NOXR的RNA-seq分析PKC1作为突变体。菌丝体在有或没有500 nM的1NA-PP1的条件下，以1,3,6,12或24 mph的速度在CM摇培养中生长48 h。n= 3次生物重复实验)。本研究的完整RNA - seq数据集可以在Gene Expression Omnibus (GEO)上找到，登录号为GSE70308。c在酵母双杂交实验中，Pkc1与Nox2和NoxR相互作用。将pGBK-PKC(诱饵载体)与pGAD-Nox2和pGAD-NoxR(猎物载体)同时共转化到Y2H Gold菌株中，激活了三个报告基因，Pkc1和NoxR在中等强度培养基(-His， - Leu， -Trp， +X-α-gal)上生长，Pkc1和Nox2在高强度培养基(-His， - Leu， -Trp， - Ade， +X-α-gal)上生长。共变换也激活了的表达MEL1，导致培养基中α-半乳糖苷酶的分泌和X-α-半乳糖的水解，使酵母菌落呈蓝色。图像代表了n= 3个独立的生物重复实验。d使用Muscle对NoxR预测氨基酸序列的一个区域进行比对40．序列守恒用灰色阴影表示，一致性阈值为75%。预测的Pkc1磷酸化位点用红色箭头标记，高度保守;黑色箭头表示基于S*APS基序的其他潜在Pkc1磷酸化靶点。e,ΔpdeH突变体产生过量的压迫胞膨胀。11和Δ的百分比pdeH暴露于0-3.5 m的甘油溶液后发生早期细胞溶解的突变体附着胞n= 3个独立的生物重复;每个重复计数50个附着子。**P< 0.01(双尾未配对学生)t以及)。fSln1-GFP在Guy11附着胞孔中的细胞定位，添加或不添加羟基脲(HU)在6 mph下，在24 mph下成像。图像具有代表性n= 3个独立的生物重复。比例尺，10µm。
补充信息
补充信息
补充信息数学模型。本文提出了稻瘟病菌侵染附着胞的几何偏微分数学模型的完整描述Magnaporthe oryzae．该模型将附着胞的进化与反应扩散方程系统联系起来，以描述附着胞控制其膨胀驱动感染机制的分子成分的时空动力学。该文件包括两个补充信息图和三个补充信息表与一个完整的指南。
补充数据
图1显示了扩展数据图7a中所示的靶向基因缺失实验的原始未裁剪的自放射线照片和相应的电泳凝胶图像。
补充表
补充表1显示了研究中使用的所有DNA寡核苷酸引物。
补充表
补充表2显示了通过LC-MS/MS分析鉴定的PKC1潜在靶点的体内磷酸化位点的总结。
视频1
视频显示了基于数学模型的附着胞介导植物侵染的模拟。模拟显示了依赖于septin的肌动蛋白重组、黑色素沉积以及与肿胀产生、力产生和再极化的关系。
视频2
预测膨胀传感器突变体中附着胞的模拟。数学模型是在没有假定的膨胀传感器的情况下运行的，这样就可以研究缺乏这种分子成分的突变体的特性。该模型预测膨压传感器突变体会产生过度的膨压和再极化损伤。
视频3
Sln1-GFP定位的激光共聚焦图像。分生孢子从m . oryzae表达Sln1-GFP基因融合的Guy11转化并接种于玻璃盖上。使用徕卡SP8激光共聚焦显微镜在24hpi下捕获三维最大投影z叠图像。
权利和权限
关于本文
引用本文
赖德，l.s.，达格达斯，y.f.，克肖，M.J.et al。一种传感器激酶控制由稻瘟病菌引起的肿胀驱动的植物感染。自然574， 423-427(2019)。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1637-x
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这篇文章是由
葡萄叶片的比较转录组学和代谢组学分析。论蚱蜢和葡萄孢菌的侵染
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