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癌症中非典型BAF复合物的剪接染色体破坏gydF4y2Ba

自然gydF4y2Ba体积gydF4y2Ba574gydF4y2Ba，gydF4y2Ba页面gydF4y2Ba432 - 436 (gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba）gydF4y2Ba引用本文gydF4y2Ba

主题gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

SF3B1是癌症中最常见的突变RNA剪接因子gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而是其中的机制gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变促进恶性肿瘤的认识很少。在这里，我们将泛癌症剪接分析与阳性富集CRISPR筛选相结合，以优先考虑促进肿瘤发生的剪接改变。我们报告说gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaBRD9是最近描述的非典型BAF染色质重塑复合物的核心成分，该复合物还包含GLTSCR1和GLTSCR1LgydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．突变体SF3B1识别出一个异常的深层内含子分支点gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba从而诱导包含来自内源性逆转录病毒元件的有毒外显子以及随后的降解gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba信使rna。BRD9的缺失导致ctcf相关位点上非典型BAF的缺失，并促进黑色素瘤的发生。BRD9在葡萄膜黑色素瘤中是一种有效的肿瘤抑制因子，因此可以纠正BRD9在葡萄膜中的错误剪接gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba-使用反义寡核苷酸或crispr定向诱变的突变细胞抑制肿瘤生长。我们的研究结果表明，非典型的BAF在不同类型的癌症携带的破坏gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变，并提出了一种基于机制的治疗方法来治疗这些恶性肿瘤。gydF4y2Ba

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图1:gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba错误剪接导致BRD9的丢失和增殖优势gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变的癌症。gydF4y2Ba
图2:突变体SF3B1识别出一个异常的深层内含子分支点gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba
图3:BRD9的缺失干扰了ncBAF复合物的形成和定位。gydF4y2Ba
图4:BRD9在黑素瘤中是一种治疗可靶向的肿瘤抑制因子。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

RNA-seq和ChIP-seq数据作为本研究的一部分被保存在基因表达Omnibus(登录号:Gene Expression Omnibus)gydF4y2BaGSE124720gydF4y2Ba)．已发表研究的RNA-seq数据从CGHub (TCGA UVMgydF4y2Ba59gydF4y2BaEMBL-EBI ArrayExpress (Illumina Human BodyMap 2.0: e - mtabb -513)，基因表达Omnibus(登录号GSE72790和GSE114922)用于慢性淋巴细胞白血病gydF4y2Ba15gydF4y2Ba还有骨髓增生异常综合征gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，分别)，或直接从作者处获得(对于UVMgydF4y2Ba10gydF4y2Ba)．凝胶源数据可在补充图中找到。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．支持本研究结果的其他数据可根据合理要求从相应作者处获得。gydF4y2Ba

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  57. Tan, G. & Lenhard, B. TFBSTools:用于转录因子结合位点分析的R/生物导体包。gydF4y2Ba生物信息学gydF4y2Ba32gydF4y2Ba， 1555-1556(2016)。gydF4y2Ba

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  58. 库拉科夫斯基，i.v.等人。HOCOMOCO:通过大规模ChIP-Seq分析获得完整的人类和小鼠转录因子结合模型。gydF4y2Ba核酸测定gydF4y2Ba．gydF4y2Ba46gydF4y2Ba， d252-d259(2018)。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  59. 罗伯逊，a.g.等。综合分析确定葡萄膜黑色素瘤的四个分子和临床亚群。gydF4y2Ba癌症细胞gydF4y2Ba32gydF4y2Ba, 204 - 220。e215（2017).

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  60. 波拉德，K. S.， Hubisz, M. J.， Rosenbloom, K. R. & Siepel .哺乳动物系统发育的非中性替代率的检测。gydF4y2Ba基因组ResgydF4y2Ba．gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba， 110-121(2010)。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  61. 麦克林，C. Y.等。GREAT提高了功能解释gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba监管区域。gydF4y2BaNat。gydF4y2Ba．gydF4y2Ba28gydF4y2Ba， 495-501(2010)。gydF4y2Ba

    中科院gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba公共医学中心gydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

下载参考gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢MSK RNAi核心设施对研究中进行的CRISPR筛选的帮助，MSK抗肿瘤评估核心设施对患者来源的异种移植实验的帮助，以及弗雷德·哈钦森/华盛顿大学癌症联盟基因组学共享资源(P30 CA015704)的支持。D.I, s.c.w.l, a.y和o.a.w。由白血病和淋巴瘤协会支持。dii由Lydia O’leary Memorial Pias皮肤病学基金会和Kobayashi癌症研究基金会资助。A.Y.得到了再生障碍性贫血和MDS国际基金会(AA&MDSIF)和劳里·施特劳斯白血病基金会的资助。s.x.l获得了征服癌症基金会和ASCO青年研究者奖，再生障碍性贫血和骨髓增生异常综合征国际基金会研究奖，以及AACR淋巴瘤研究奖学金的支持。g.l.c.是马汉研究员。O.A.-W。得到了潘兴广场孙氏癌症研究联盟、亨利和玛丽莲·陶博基金会和斯塔尔癌症联盟的支持。R.K.B.是白血病和淋巴瘤协会的学者(1344-18)，并得到美国国立卫生研究院的部分支持(R01 DK103854)。 O.A.-W. and R.K.B. are supported by the Evans MDS Foundation, the US National Institutes of Health (R01 HL128239) and the Department of Defense Bone Marrow Failure Research Program (BM150092 and W81XWH-12-1-0041). The results shown here are in part based upon data generated by the TCGA research network (https://cancergenome.nih.gov/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

作者指出gydF4y2Ba

  1. 这些作者贡献均等:井上大一，周国良gydF4y2Ba

作者及隶属关系gydF4y2Ba

  1. 人类肿瘤和发病机制项目，纪念斯隆凯特琳癌症中心，纽约，纽约，美国gydF4y2Ba

    井上大一、刘波、泰勒·希区曼、斯坦利·李春伟、莉莉安·比特纳、阿里尔·Block、阿曼达·r·摩尔、Akihide Yoshimi、Luisa Escobar-Hoyos、Hana Cho、Alex Penson、Sydney X. Lu、Justin Taylor、Yu Chen和Omar Abdel-WahabgydF4y2Ba

  2. 日本神户生物医学研究与创新基金会，神户生物医学研究与创新研究所血液肿瘤科gydF4y2Ba

    井上大地gydF4y2Ba

  3. 计算生物学项目，公共卫生科学部，弗雷德哈钦森癌症研究中心，西雅图，华盛顿州，美国gydF4y2Ba

    周国良，约瑟夫·潘加洛，克里斯蒂娜·诺斯和罗伯特·k·布拉德利gydF4y2Ba

  4. 美国华盛顿州西雅图市Fred Hutchinson癌症研究中心基础科学部gydF4y2Ba

    周国良，约瑟夫·潘加洛，克里斯蒂娜·诺斯和罗伯特·k·布拉德利gydF4y2Ba

  5. Dana-Farber癌症研究所儿科肿瘤科，波士顿，马萨诸塞州，美国gydF4y2Ba

    布列塔尼·米歇尔gydF4y2Ba

  6. 麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所，剑桥，马萨诸塞州，美国gydF4y2Ba

    Brittany C. Michel, Andrew R. D 'Avino & Cigall KadochgydF4y2Ba

  7. 美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院生物医学和生物科学项目gydF4y2Ba

    Brittany C. Michel, Andrew R. D 'Avino & Cigall KadochgydF4y2Ba

  8. 美国华盛顿州西雅图华盛顿大学基因组科学系gydF4y2Ba

    克里斯蒂娜·诺斯和罗伯特·k·布拉德利gydF4y2Ba

  9. 美国纽约纪念斯隆凯特琳癌症中心医学系gydF4y2Ba

    Chen Yu & Omar Abdel-WahabgydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba
  1. 井上大地gydF4y2Ba
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    您也可以在gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

  2. 郭良齐咀嚼gydF4y2Ba
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  3. Bo刘gydF4y2Ba
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  4. 布列塔尼·米歇尔gydF4y2Ba
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  5. 约瑟夫PangallogydF4y2Ba
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  6. 安德鲁·r·达维诺gydF4y2Ba
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  7. 泰勒HitchmangydF4y2Ba
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  8. Khrystyna北gydF4y2Ba
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  9. 李俊伟gydF4y2Ba
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  10. 莉莲Bitner拍摄gydF4y2Ba
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  11. Ariele块gydF4y2Ba
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  12. 阿曼达·r·摩尔gydF4y2Ba
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  13. Akihide辺喜美认为正是gydF4y2Ba
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  14. 路易莎Escobar-HoyosgydF4y2Ba
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  15. Hana曹gydF4y2Ba
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  16. 亚历克斯随缘吧gydF4y2Ba
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  17. 雪梨·x·陆gydF4y2Ba
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  18. 贾斯汀•泰勒gydF4y2Ba
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  19. 陈昱gydF4y2Ba
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  20. Cigall KadochgydF4y2Ba
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  21. 奥马尔躲开gydF4y2Ba
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  22. 罗伯特·k·布拉德利gydF4y2Ba
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    您也可以在gydF4y2BaPubMedgydF4y2Ba谷歌学者gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

D.i, g.l.c, b.c.m, c.k, o.a.w。和r.k.b设计了这项研究。D.I, B.L.和J.P.进行了小基因测定。d.i.， B.C.M.和C.K.进行了ChIP-seq实验。a.r.d.， g.l.c.和C.K.进行了ChIP-seq分析。g.l.c.、k.n.、A.P.和R.K.B.对CRISPR筛选、RNA剪接和基因表达数据进行了计算分析。D.I.和s.x.l进行了CRISPR筛选。D.I.和B.L.在体外实验中生成并验证了抗brd9 PE morpholinos。D.I, l.b.， a.b.， s.c.w l, A.Y.和H.C.进行小鼠实验。A.R.M, D.I.和l.e.h。 performed experiments using pancreatic cancer cell lines. T.H. and Y.C. provided melanoma cell lines. D.I., G.-L.C., O.A.-W. and R.K.B. prepared the manuscript with help from all co-authors. J.T. and O.A.-W. provided clinically annotated samples from the MSK Hematology/Oncology Tissue Bank and from the MSK Antitumor Assessment Core Facility. O.A.-W. and R.K.B. provided funding and study supervision.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba奥马尔躲开gydF4y2Ba或gydF4y2Ba罗伯特·k·布拉德利gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

C.K.是Foghorn Therapeutics的科学创始人、信托董事会成员、科学顾问委员会成员、顾问和股东，这些都与当前的手稿无关。O.A.-W。曾担任H3 Biomedicine, Foundation Medicine, Merck和Janssen的顾问;O.A.-W。收到了第一三共的个人演讲费。O.A.-W。曾获得H3生物医学之前的研究资助，与目前的手稿无关。O.A.-W组长。和r.k.b是弗雷德·哈钦森癌症研究中心提交的一项临时专利申请的发明人，该申请涵盖了BRD9在癌症中的激活。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

同行评审信息gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba感谢Boris Bastian、Rotem Karni和其他匿名审稿人对本工作的同行评审所作的贡献。gydF4y2Ba

扩展的数据图形和表格gydF4y2Ba

扩展数据图1gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba错误拼接gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba-突变的人类细胞，而BRD9的缺失赋予了增殖优势。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，比较TCGA UVM队列患者之间差异剪接(ΔPSI)的散点图gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变或野生型gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba59gydF4y2Ba（gydF4y2BaxgydF4y2BaAxis)和来自骨髓增生异常综合征队列的患者gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变或野生型gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba27gydF4y2Ba（gydF4y2BaygydF4y2Ba轴)。事件被分类为替代3 '剪接位点或跳过外显子。gydF4y2BabgydF4y2Ba，−log的Rank图gydF4y2Ba10gydF4y2Ba(FDR)与我们的CRISPR-Cas9阳性选择筛选中的每个sgRNA相关。sgRNAs靶向阳性对照(gydF4y2BaPtengydF4y2Ba),gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba突出显示。对于探针水平(每个sgrna)的分析，我们拟合了一个负二项式广义对数线性模型，并进行了似然比检验。FDR值采用Benjamini-Hochberg方法计算。gydF4y2BacgydF4y2Ba，针对阳性对照的sgRNAs的Read计数(gydF4y2BaPtengydF4y2Ba)或gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba．D0和D7表示停用IL-3后的天数。gydF4y2BadgydF4y2Ba，热图总结了竞争试验的结果，以测量每种所示sgRNA对表达cas9的Ba/F3细胞生长的影响。用非靶向(对照)sgRNA处理的细胞和GFP的百分比计算细胞生长gydF4y2Ba+gydF4y2Ba第14天的细胞归一化至第2天的百分比。所示值对应于平均计算值gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物重复。gydF4y2BaRpa3gydF4y2Basgrna作为阴性对照。gydF4y2BaegydF4y2Ba，如gydF4y2BadgydF4y2Ba，但对于32Dcl3细胞。gydF4y2BafgydF4y2Ba，如gydF4y2BadgydF4y2Ba除指征黑素瘤和胰导管腺癌细胞外。gydF4y2BaggydF4y2Ba，如gydF4y2BadgydF4y2Ba，但对于RN2细胞。gydF4y2BahgydF4y2Ba的序列守恒gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba通过phyloP估计毒性外显子位点gydF4y2Ba60gydF4y2Ba．保守和重复元素注释来自UCSC基因组浏览器gydF4y2Ba43gydF4y2Ba．gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， RT-PCR分析gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba毒外显子包合使用整个骨髓细胞gydF4y2BaMx1-cre Sf3b1gydF4y2BaWT / WTgydF4y2Ba(WT / WT)gydF4y2BaMx1-cre Sf3b1gydF4y2BaK700E / WTgydF4y2Ba(K700E / WT)老鼠。pIpC治疗3周后，使用与用于检测的小鼠引物进行RT-PCRgydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba人类细胞中的有毒外显子包涵物。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个技术上独立的复制。gydF4y2BajgydF4y2Ba， RT-PCR分析确认突变体- sf3b1依赖性包涵体gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba有毒外显子在等基因NALM-6细胞系工程包含指示的突变。gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700KgydF4y2Ba是基因组工程的野生型控制。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个技术上独立的复制。gydF4y2BakgydF4y2BaWestern blot检测过表达n端Flag-tagged野生型K562细胞中Flag、SF3B1和BRD9的表达gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba或gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Bacdna，或者一个空的载体;此面板对应于中计算的单元格gydF4y2Ba米gydF4y2Ba．代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个生物独立的重复。gydF4y2BalgydF4y2BaWestern blot检测强力霉素诱导K562细胞中SF3B1的表达gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba-靶向shRNA或非靶向对照shRNA (shRen);此面板对应于中计算的单元格gydF4y2Ba米gydF4y2Ba．代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个技术上独立的复制。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba， RT-PCR说明特异性gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba有毒外显子包含gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba-突变的细胞。这些细胞包括用对照shRNA (shRen)处理的K562细胞gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba-靶向shrna(列标记为“K562 knock-down”);敲入gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700KgydF4y2Ba，gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba或gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK666NgydF4y2Ba突变成内源性基因座gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba(列有“K562敲入”字样);或者野生型的过度表达gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba或gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2BacDNA(列标为“K562 cDNA”)。最右边的两条线显示野生型急性髓系白血病细胞系gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba(MV4;11)或自然产生的内源性gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba突变(HNT34细胞;列标记为“白血病细胞系”)。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BangydF4y2Ba，如gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，但对于胰导管腺癌细胞系(左)，UVM细胞系(中)和一组慢性淋巴细胞白血病患者(右)。CFPAC1和MIA的PaCa2细胞缺乏gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变;Panc05;04细胞携带gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaQ699H / K700EgydF4y2Ba；UPMD1和MEL270细胞缺乏gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变;MEL202和UPMD2细胞携带gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaR625GgydF4y2Ba而且gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaY623HgydF4y2Ba分别突变。慢性淋巴细胞白血病患者的样本标识符对应于补充表中所示的基因型gydF4y2Ba7gydF4y2Ba．代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个技术上独立的实验(左和中)和gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验(右)。gydF4y2BaogydF4y2Ba， RNA-seq读取覆盖图gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba中毒外显子位点来自病人样本gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba基因型。所有gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba-突变样本展示gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba有毒外显子包含。gydF4y2BapgydF4y2Ba，如gydF4y2BaogydF4y2Ba，但用于健康捐赠者的指定组织(来自BodyMap 2.0)。gydF4y2Ba问gydF4y2Ba， qRT-PCR测定等基因K562中毒外显子包合体(左)和排除异构体(右)的半衰期gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba用指定的shrna和放线菌素D处理细胞抑制转录。NMD抑制gydF4y2BaUPF1gydF4y2Ba敲除稳定内含物，但不排除异构体。红色箭头表示用于特异性检测两种亚型的引物。gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个生物独立实验和gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个技术上独立的包含异构体实验;gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术上独立的排除异构体实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值采用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试8小时。gydF4y2BargydF4y2Ba中，柱状图显示了在指定条件下估计的毒素外显子包合异构体半衰期gydF4y2Ba问gydF4y2Ba．误差条，平均值+ s.d。gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个生物独立实验和gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个技术上独立的实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值采用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，如gydF4y2BargydF4y2Ba，但排除异构体。误差条，平均值+ s.d。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术上独立的实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值采用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BatgydF4y2Ba，如gydF4y2Ba问gydF4y2Ba，但NALM-6gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba细胞。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术上独立的包含异构体和排除异构体实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值采用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba-测试8小时。gydF4y2BaugydF4y2Ba，如gydF4y2BargydF4y2Ba，但NALM-6gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba细胞。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术上独立的实验。误差条，平均值+ s.d。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值采用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BavgydF4y2Ba，如gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba，但NALM-6gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba细胞。误差条，平均值+ s.d。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术上独立的实验。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值采用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BawgydF4y2BaWestern blot检测NALM-6细胞中BRD9的表达gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变。肌动蛋白，负荷控制。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BaxgydF4y2Ba，的秩图gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba内含毒外显子(0 - 1;上图)和基因表达的箱形图(插图)gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变状态(数据来自骨髓增生异常综合征或UVM患者的队列，如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变与高毒性外显子包含和低毒性外显子包含密切相关gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba表达式。方框表示第1和第3个四分位数，胡须延伸到1.5×四分位数范围。gydF4y2BaPgydF4y2Ba用单边曼-惠特尼计算的值gydF4y2BaUgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

扩展数据图2突变体SF3B1识别内部的异常分支点gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba促进毒性外显子包涵，导致全长BRD9蛋白的丢失。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，说明HA标记敲入内源性的策略的示意图gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba轨迹。单链供体DNA含有197 nt片段，其中83 nt与DNA同源gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba5 ' UTR (HA标签上游)和87 nt同源于gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba外显子1(起始密码子下游)。gydF4y2BabgydF4y2Ba，基因组DNA的Sanger测序验证了HA标签在K562中的成功敲入gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba细胞。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个生物独立实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba， Western blot结合抗brd9(左)、抗ha(右上)或抗肌动蛋白(右下)检测K562gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba携带内源性n端ha标记的BRD9的细胞。白色箭头，非特定的条纹。红色箭头表示BRD9蛋白的预期大小。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BadgydF4y2BaWestern blot检测多西环素诱导的Flag-tagged野生型SF3B1或Flag-tagged SF3B1(K700E) MEL270细胞中Flag、SF3B1和内源性BRD9蛋白。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba，对包含(上)(外显子14 -外显子14a剪接)或排除(下)(外显子14 -外显子15剪接)的链的逆转录产生的cDNA进行Sanger测序gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba用强力霉素诱导的Flag-tagged野生型SF3B1(下)或Flag-tagged SF3B1(K700E)(上)在MEL270细胞中的毒外显子。分支点如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba，如gydF4y2BaegydF4y2Ba，但对于T47D细胞。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BaggydF4y2Ba，如Fig。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba而在强力环素诱导的Flag-tagged SF3B1(K700E)诱导的T47D细胞中显示的小基因突变。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BahgydF4y2Ba对转染sirna的K562细胞的U2AF2、U2AF1和组蛋白H3进行Western blot检测gydF4y2BaU2AF1gydF4y2Ba和/或gydF4y2BaU2AF2gydF4y2Ba(上)和柱状图说明平均值gydF4y2BaBRD9gydF4y2BasiRNA敲除后，通过定量PCR (qPCR)检测毒外显子包体gydF4y2BaU2AF1gydF4y2Ba和/或gydF4y2BaU2AF2gydF4y2Ba(底部)。实验用gydF4y2BangydF4y2Ba= 1个siRNA转染的生物独立复制gydF4y2BangydF4y2Ba= 1技术上独立的复制western blot和gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术上独立的RT-PCR重复。全部计算毒外显子包含量gydF4y2BangydF4y2Ba= 3 × 3 (9) RT-PCR技术重复组合，用于包含和排除异构体。条形图显示的是平均包容度。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BaEPB49gydF4y2BasiRNA敲除后，qPCR检测盒式外显子包裹体gydF4y2BaU2AF1gydF4y2Ba和/或gydF4y2BaU2AF2gydF4y2Ba．随着gydF4y2BaEPB49gydF4y2Ba卡式外显子依赖于u2af，本实验可作为其功能疗效的阳性对照gydF4y2BaU2AF1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaU2AF2gydF4y2Ba可拆卸的。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术上独立的实验。卡式外显子包含量全部计算gydF4y2BangydF4y2Ba= 3 × 3 (9) RT-PCR技术重复组合，用于包含和排除异构体。条形图显示的是平均包容度。gydF4y2BajgydF4y2Ba，如Fig。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba而在强力环素诱导的Flag-tagged SF3B1(K700E)诱导的T47D细胞中显示的小基因突变。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BakgydF4y2Ba，如Fig。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba而在强力环素诱导的Flag-tagged SF3B1(K700E)诱导的T47D细胞中显示的小基因突变。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BalgydF4y2Ba在表达空载体或n端Flag标记野生型的MEL270细胞中，Western blot检测Flag、SF3B1、BRD9和actingydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba，gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaR625HgydF4y2Ba或gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba互补脱氧核糖核酸。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2Ba米gydF4y2Ba， RT-PCR分析gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba在表达强力霉素诱导的空载体、野生型SF3B1、SF3B1(R625H)或SF3B1(K700E)的MEL270细胞中剪接。左栏显示小基因剪接，右栏显示内源性剪接gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba拼接。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BangydF4y2Ba，如gydF4y2Ba米gydF4y2Ba，但毒性外显子5 '端所示的小基因突变。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BaogydF4y2Ba，在5 '端产生突变gydF4y2BaBRD9gydF4y2Bacrispr - cas9介导的MEL202细胞的毒性外显子(gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaR625GgydF4y2Ba)．PAM序列用大写字母，下划线的核苷酸表示。红色核苷酸与sgRNA杂交。替换用小写的，下划线的核苷酸表示。gydF4y2BapgydF4y2Ba，如gydF4y2BaogydF4y2Ba，但对MEL270细胞。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2Ba问gydF4y2Ba，如Fig。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba但对于MEL270细胞。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BargydF4y2Ba，如Fig。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba底部，但对于MEL270细胞。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

BRD9漏失破坏ncBAF复合体的形成。gydF4y2Ba

一个gydF4y2BaTCGA队列中典型BAF、多溴相关BAF和ncBAF成分的突变率。gydF4y2BabgydF4y2BaWestern blot检测3×Flag-BRD9-expressing K562细胞中Flag-tagged BRD9蛋白的表达。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BacgydF4y2Ba内源性蛋白快速免疫沉淀质谱(RIME)实验流程gydF4y2Ba33gydF4y2Ba用于纯化和鉴定BRD9的染色质相关相互作用伙伴。gydF4y2BadgydF4y2Ba，与IgG或Flag交联和免疫沉淀，然后用相应抗体检测。数据来自3×Flag-BRD9-expressing MEL270细胞。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba， GLTSCR1免疫沉淀，western blottinggydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba敲入NALM-6细胞。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba，免疫沉淀GLTSCR1(上)或BRG1(下)，然后用指示抗体在K562细胞中用crispr介导的BRD9敲除(KO)进行印迹。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BaggydF4y2BaBRD9全长(FL)蛋白和我们构建的缺失突变体的示意图。BD bromodomain;DUF，未知函数域;N, BRD9的氨基酸1-133;N + BD, BRD9的氨基酸1-242;N + BD + DUF, BRD9的氨基酸1-505;BRD9的134 ~ 597氨基酸dN;BRD9 bromodomain缺失突变体dBD;BRD9的duf结构域缺失突变体。gydF4y2BahgydF4y2Ba，在表达3×Flag-tagged版本缺失突变体的293T细胞中进行免疫沉淀，随后检测GLTSCR1或GLTSCR1L(免疫印迹，IB)。缺失突变体示于gydF4y2BaggydF4y2Ba．代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2Ba

图4 BRD9缺失导致GLTSCR1的重新定位远离ctcf相关位点。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，如Fig。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba，但说明相对于转录起始位点(tss)的相对位置。gydF4y2BabgydF4y2Ba，如Fig。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba，但对于brg1结合位点的基序。gydF4y2BangydF4y2Ba= 401个转录因子分析。gydF4y2BacgydF4y2Ba紊乱图描述了MEL270细胞中gltscr1结合位点与指示治疗的重叠。gydF4y2BadgydF4y2Ba，火山图显示了转录因子在brd9敏感位点和构成型gltscr1结合位点的平均motif得分的差异。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba，以及相关的统计学意义。gydF4y2BangydF4y2Ba= 401个转录因子分析。gydF4y2BaPgydF4y2Ba用双面曼-惠特尼计算的值gydF4y2BaUgydF4y2Ba以及。gydF4y2BaegydF4y2Ba，如gydF4y2BacgydF4y2Ba，但对于brg1结合位点。gydF4y2BafgydF4y2Ba，如gydF4y2BadgydF4y2Ba，但对于brg1结合位点。gydF4y2BangydF4y2Ba= 401个转录因子分析。gydF4y2BaggydF4y2Ba，从基因组区域丰富注释工具(GREAT)分析中选择丰富的注释术语gydF4y2Ba61gydF4y2Babrd9敏感和gltscr1结合位点附近的基因。图说明−loggydF4y2Ba10gydF4y2Ba(FDR)，用单侧二项检验计算，并使用Benjamini-Hochberg程序对多重检验进行校正。O和E分别是观察到的和预期的基因数量。gydF4y2BahgydF4y2Ba，基因表达的差异gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba在TCGA UVM队列中，MEL270细胞中鉴定出gltscr1结合启动子的基因与野生型样本相比发生了突变。颜色表示峰对BRD9损失的响应性。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，从GLTSCR1 ChIP-seq (MEL270细胞)和RNA-seq (TCGA UVM队列)周围读取覆盖gydF4y2BaNFATC2IPgydF4y2Ba．红色梯形表示GLTSCR1在启动子中结合，在BRD9降解物处理或表达后结合减少gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba．gydF4y2BaNFATC2IPgydF4y2Ba在UVM样本中表达显著差异gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba相对于野生型样本的突变。通过将ChIP-seq读覆盖归一化到映射的文库大小，将RNA-seq读覆盖归一化到映射的文库大小，限制为编码基因，纵轴尺度具有可比性。进行ChIP-seq实验gydF4y2BangydF4y2Ba= 1个生物独立复制。gydF4y2BajgydF4y2Ba，如gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，但对于gydF4y2BaSETD1AgydF4y2Ba．gydF4y2BaSETD1AgydF4y2Ba在UVM样本中表达显著差异gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba相对于野生型样本的突变。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

扩展数据图5 BRD9是UVM中一种有效的肿瘤抑制因子。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba两种非靶向shrna处理Melan-a细胞的体外生长曲线gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba(shRen)和荧光素酶(shLuc))和亲本，未经操纵的Melan-a细胞。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组3个生物独立实验数据以均数±标准差表示。gydF4y2BabgydF4y2Ba在SCID小鼠皮下注射表达对照shRNA的Melan-a细胞(对抗肿瘤体积)gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba)， shRNA反对gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba（gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba成分不。1和no。2)， shRNA反对gydF4y2Ba缺失gydF4y2Ba或cDNA编码CYSLTR2(L129Q) (gydF4y2BangydF4y2Ba= 8只/组)。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BaPgydF4y2Ba计算第64天的值与gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba带有双侧的shRNA基团gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BacgydF4y2Ba，解剖黑素瘤的代表图像gydF4y2BabgydF4y2Ba．gydF4y2BadgydF4y2Ba，黑素瘤的H&E图像gydF4y2BabgydF4y2Ba．比例尺，100 μm。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BaegydF4y2Ba， qRT-PCR检测表达gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba(左)和黑素瘤相关基因(gydF4y2BaMitfgydF4y2Ba，gydF4y2BaDctgydF4y2Ba，gydF4y2BaPmelgydF4y2Ba而且gydF4y2BaTyrp1gydF4y2Ba)的黑色素瘤gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba= 4 (gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba成分),gydF4y2BangydF4y2Ba= 5 (gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba成分不。1和no。2)生物独立实验。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值采用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BafgydF4y2Ba，小鼠移植的亲本，未经操作的Melan-a细胞或Melan-a细胞转导非靶向shRNA或gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba针对成分。细胞被皮下移植到SCID小鼠，移植后36天估计肿瘤体积。gydF4y2BaggydF4y2Ba肿瘤的体积gydF4y2BafgydF4y2Ba第36天。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组10个肿瘤。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值通过双面法相对于亲本组计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

扩展数据图6 BRD9是UVM中一种有效的肿瘤抑制因子。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，静脉注射B16细胞或不注射B16细胞后14天肺转移灶的代表性图像gydF4y2BaBrd9gydF4y2BashRNA (MLS-E载体)。比例尺，5毫米。gydF4y2BabgydF4y2Ba注射前即刻Western blot检测B16细胞内源性BRD9。肌动蛋白，负荷控制。实验重复了三次，得到了相似的结果。gydF4y2BacgydF4y2Ba肺转移灶H&E切片。箭头表示转移灶。比例尺，100 μm。实验重复了三次，得到了相似的结果。gydF4y2BadgydF4y2Ba，实验中发现的肺B16转移的数量gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba每组6只。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值的计算相对于gydF4y2BaRenillagydF4y2BashRNA基团由双侧组成gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BaegydF4y2Ba，绿色荧光蛋白的相对比例gydF4y2Ba+gydF4y2Ba有或没有92.1单元格gydF4y2BaBRD9gydF4y2BashRNA (MLS-E载体)，通过流式细胞术分析受体NSG (NOD-SCID)肺组织评估gydF4y2BaIl2rggydF4y2Ba−−/gydF4y2Ba)小鼠尾静脉注射后14 d。信号通过除以绿色荧光蛋白的平均百分比进行归一化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞在gydF4y2BaRenillagydF4y2BashRNA(对照)组。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组5个生物独立实验gydF4y2BaPgydF4y2Ba值的计算相对于gydF4y2BaRenillagydF4y2BashRNA基团由双侧组成gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BafgydF4y2Ba，肺转移瘤切片的抗gfp免疫组化gydF4y2BaegydF4y2Ba．比例尺，200 μm。实验重复了三次，得到了相似的结果。gydF4y2BaggydF4y2Ba，由强力环素诱导转导的黑色素a细胞移植产生的肿瘤的代表性图像gydF4y2BaBrd9gydF4y2Ba成分。左为强力霉素9周，右为强力霉素停药3周。gydF4y2BahgydF4y2Ba，肿瘤体积为实验gydF4y2BaggydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba每组4只。实验重复了两次，得到了相似的结果。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值通过双面法相对于亲本组计算gydF4y2BatgydF4y2Ba-在第7天、第14天和第21天进行测试。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， 12天移植空载体、全长BRD9 (BRD9 WT)或BRD9 bromodomain缺失突变体(BRD9 ΔBD)的MEL270细胞的受体小鼠的代表性图像。gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 5只小鼠。gydF4y2BajgydF4y2Ba一项竞争性试验的结果，以测量所示cdna的表达对所示黑素瘤细胞生长的影响。通过共表达GFP (pMIGII载体)鉴定转导细胞。绿色荧光蛋白的百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞被追踪了21天，并在第2天归一化到GFP百分比。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组2个生物独立实验。gydF4y2BakgydF4y2Ba一项竞争性试验的结果，以测量所示cdna的表达对所示黑素瘤细胞生长的影响。通过共表达GFP (pMIGII载体)鉴定转导细胞。绿色荧光蛋白的百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba对细胞进行为期10天的跟踪，并在第3天归一化至GFP百分比。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组2个生物独立实验。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图7 BRD9调节gydF4y2BaHTRA1gydF4y2Ba促进UVM肿瘤的发生。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，表示折叠变化的Rank图(以对数表示)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，通过比较TCGA UVM队列中突变型和野生型患者的样本，鉴定出每个显著差异表达基因gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba．该图谱仅限于在BRD9启动子或基因体内具有BRD9 ChIP-seq峰值的基因(用DMSO处理的MEL270细胞或野生型SF3B1异位表达后)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3122个基因分析，其中gydF4y2BangydF4y2Ba= 248符合显著性(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)和表达(野生型和突变型样本的中位表达量为每百万>个转录本)阈值，因此在这里说明。gydF4y2BaPgydF4y2Ba值采用双面曼-惠特尼计算gydF4y2BaUgydF4y2Ba以及。gydF4y2BabgydF4y2Ba，如gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，但一个火山图补充说明gydF4y2BaPgydF4y2Ba之间的比较相关的值gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba-突变型和野生型gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba样本。gydF4y2BangydF4y2Ba= 3122个基因分析和说明。gydF4y2BaPgydF4y2Ba用双面曼-惠特尼计算的值gydF4y2BaUgydF4y2Ba以及。gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BaHTRA1gydF4y2Ba在TCGA UVM队列患者样本中的表达(gydF4y2BangydF4y2Ba= 18)或没有(gydF4y2BangydF4y2Ba= 62)gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变。表达式是gydF4y2BazgydF4y2Ba-所有样本的得分归一化。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BaPgydF4y2Ba用双面计算的值gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BadgydF4y2BaWestern blot检测MEL270细胞中Flag、SF3B1、HTRA1、BRD9和肌动蛋白(野生型)gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba)，用DMSO、BRD9降解剂、Flag-SF3B1 (WT)或Flag-SF3B1 (K700E)处理。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BaegydF4y2BaWestern blot检测MEL202细胞中HTRA1、BRD9和肌动蛋白(gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaR625GgydF4y2Ba)在crispr - cas9介导的突变后gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba毒性外显子(如图扩展数据图。gydF4y2Ba2 ogydF4y2Ba)．代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个技术上独立的实验。gydF4y2BafgydF4y2Ba，读取BRG1, BRD9和GLTSCR1 ChIP-seq的覆盖范围gydF4y2BaHTRA1gydF4y2BaMEL270细胞中的基因座(见gydF4y2BadgydF4y2Ba)用空载体、BRD9降解剂或gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaWTgydF4y2Ba或gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaK700EgydF4y2Ba互补脱氧核糖核酸(gydF4y2BangydF4y2Ba=每个条件进行1个ChIP-seq实验)。gydF4y2BaggydF4y2BaWestern blot检测经shrna处理的MEL270细胞中HTRA1和actin的表达gydF4y2BaHTRA1gydF4y2Ba或与非靶向对照shRNA(对抗gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba)．代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BahgydF4y2Ba热图总结了一项竞争分析的结果，以测量每种指示shRNA对表达cas9的野生型UVM细胞系生长的影响gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba．细胞生长计算与非靶向对照shRNA处理的细胞(对抗gydF4y2BaRenillagydF4y2Ba)和绿色荧光蛋白的百分比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba第14天的细胞归一化至第2天。所示的值对应于计算的平均值gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba， Western blot检测MEL202细胞中HTRA1和肌动蛋白(gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaR625GgydF4y2Ba)后稳定过表达空载体或HTRA1(均与MSCV-IRES-GFP载体)。代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2BajgydF4y2Ba，绿色荧光蛋白的比例gydF4y2Ba+gydF4y2Ba以绿色荧光蛋白gydF4y2Ba−gydF4y2BaMEL202细胞(gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaR625GgydF4y2Ba)来自一个竞争实验，其中GFPgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞gydF4y2Ba我gydF4y2Ba与GFP的初始比例为1:1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba控制细胞。数据以平均值表示gydF4y2BangydF4y2Ba= 2个生物独立实验。gydF4y2BakgydF4y2Ba，表达空载体或MEL202细胞的集落数gydF4y2BaHTRA1gydF4y2Ba互补脱氧核糖核酸的gydF4y2Ba我gydF4y2Ba在软琼脂中生长10天后。数据以平均值表示gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个生物独立实验。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

扩展数据图8 crispr - cas9介导的基因突变gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba毒外显子纠正gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba异常的拼接和取消的增长gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变的黑色素瘤。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba， MEL270细胞的菌落数(野生型)gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba)没有(对照)或有(克隆1、克隆2和克隆3)crispr - cas9诱导的中断索引gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba毒外显子识别。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组3个生物独立实验gydF4y2BabgydF4y2Ba，代表图像来自gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．gydF4y2BacgydF4y2Ba中所描述的克隆的增殖gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba=每组3个生物独立实验gydF4y2BadgydF4y2BaMEL285细胞的增殖(野生型)gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba)没有(对照)或有(克隆1、2和3)crispr - cas9诱导的中断索引gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba毒外显子识别。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组3个生物独立实验gydF4y2BaegydF4y2Ba，在5 '端产生突变gydF4y2BaBRD9gydF4y2Bacrispr - cas9介导的MEL285克隆1、2和3中的毒性外显子gydF4y2BadgydF4y2Ba．PAM序列用大写字母，下划线的核苷酸表示。红色核苷酸与sgRNA杂交。gydF4y2BafgydF4y2Ba，来自移植了crispr - cas9修饰的MEL202克隆的受体小鼠的解剖肿瘤的代表性图像。gydF4y2BaggydF4y2Ba，所示肿瘤的肿瘤重量gydF4y2BafgydF4y2Ba．数据以均数±标准差表示。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组6个生物独立实验gydF4y2BaPgydF4y2Ba值相对于对照shRNA组用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BahgydF4y2Ba中所示肿瘤的H&E染色及Ki-67免疫组化图像gydF4y2BafgydF4y2Ba．代表性图片来自gydF4y2BangydF4y2Ba= 3个独立的组织学分析。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

图9校正gydF4y2BaBRD9gydF4y2Bamis-splicing在gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba-突变的ASOs异种移植抑制肿瘤生长。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，卡通代表的gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba每个设计的morpholino所针对的位点。熔化温度(gydF4y2BaTgydF4y2Ba米gydF4y2Ba)。目标序列的长度用括号表示;如果没有标明这些，那么长度是25nt。gydF4y2BabgydF4y2Ba， MEL202细胞的生长(gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaR625GgydF4y2Ba)用10 μM的对照非靶向(对照)处理gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba以毒素外显子为目标的morpholinos(没有。3,没有。6和no。7)。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组3个生物独立实验gydF4y2BaPgydF4y2Ba第9天的数值相对于对照组用双面法计算gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BacgydF4y2Ba，移植MEL202细胞并在体内用PBS或morpholinos处理的受体小鼠的代表性图像。每个肿瘤在PBS、对照吗啡啉诺或吗啡啉诺体内治疗后进行分析gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba毒外显子(没有。6)(12.5毫克/公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba，每隔一天至共8次瘤内注射)。gydF4y2BangydF4y2Ba=每组10个肿瘤。gydF4y2BadgydF4y2Ba中描述的实验中解剖肿瘤的代表性图像gydF4y2BacgydF4y2Ba．gydF4y2BaegydF4y2Ba，肿瘤的RT-PCR结果gydF4y2BacgydF4y2Ba评估gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba拼接。实验重复了三次，得到了相似的结果。gydF4y2BafgydF4y2Ba肿瘤的典型H&E和Ki-67染色图像gydF4y2BacgydF4y2Ba．比例尺，100 μm(上)，50 μm(中、下)。实验重复了三次，得到了相似的结果。gydF4y2BaggydF4y2Ba，用患者来源的异种移植模型移植的受体小鼠的肿瘤体积估计gydF4y2BaSF3B1gydF4y2BaR625CgydF4y2Ba直肠黑色素瘤和体内吗啡啉诺治疗(对照或吗啡啉诺抗gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba有毒外显子，不是。6)(12.5毫克/公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba，每隔一天至共8次瘤内注射)。gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 5只小鼠。显示了治疗前后估计的肿瘤体积。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值计算相对于对照组的双面gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BahgydF4y2Ba，肿瘤的代表性H&E染色图像gydF4y2BaggydF4y2Ba．实验重复了三次，得到了相似的结果。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，肿瘤代表性Ki-67染色图像gydF4y2BaggydF4y2Ba．实验重复了三次，得到了相似的结果。gydF4y2BajgydF4y2Ba，用患者来源的UVM异种移植模型(野生型)移植的受体小鼠的肿瘤体积估计gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba)，用体内morpholino(对照或抗gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba有毒外显子，不是。6)(12.5毫克/公斤gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba，每隔一天至共8次瘤内注射)。gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 5只小鼠。显示了治疗前后估计的肿瘤体积。数据以均数±标准差表示。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值计算相对于对照组的双面gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2BakgydF4y2Ba，肿瘤解剖的代表性图像gydF4y2BajgydF4y2Ba．gydF4y2BalgydF4y2Ba，来自肿瘤的肿瘤权重gydF4y2BakgydF4y2Ba．gydF4y2BangydF4y2Ba每组= 5只小鼠。gydF4y2BaPgydF4y2Ba数值计算相对于对照组的双面gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。gydF4y2Ba

源数据gydF4y2Ba

扩展数据图10多个不同的NMD异构体的使用gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba说明本构的基因结构gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba外显子和选择性剪接事件被预测可诱导NMD。gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba突变促进BRD9毒性外显子包含在内含子14中。gydF4y2BabgydF4y2Ba，每个nmd诱导事件的基因组坐标(hg19/GRCh37组装)，如图所示gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，以及每个交替拼接区域的基因组序列，以红色突出显示gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．第三列表示预测的NMD底物的特定异构体。Prox，内含子-近端竞争3 '剪接位点;区域，内含子-远端竞争性3 '剪接位点;Inc，外显子包含;Exc，外显子排除。gydF4y2BacgydF4y2Ba，说明每种nmd诱导亚型相对于总亚型水平的Rank图gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba每个TCGA队列中每个样本的mRNA水平。方框表示第一和第三四分位数，胡须延伸到1.5×四分位数范围。gydF4y2BadgydF4y2Ba，表示通过拟合线性模型进行预测估计的系数分布的箱形图gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba以每种nmd诱导亚型的相对水平为基础的基因表达。nmd诱导亚型的相对水平在gydF4y2BacgydF4y2Ba，以及gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba每个样本的基因表达估计值，用于为每个TCGA队列构建具有稳健回归的独立线性模型。该模型拟合过程产生的系数在箱形图中显示，其中每个点对应于单个TCGA队列中与相应nmd诱导事件相关的系数。TCGA UVM队列的系数用红色突出显示。系数通常为负(如预期的NMD诱导异构体)，除了本构外显子9跳除，其系数一般为正——如预期的，当本构外显子被排除时，NMD被诱导。的gydF4y2BaSF3B1gydF4y2Ba如预期的那样，内含子14中的-突变响应毒性外显子主导了UVM的适合度。gydF4y2BangydF4y2Ba= 33个TCGA队列分析和说明。gydF4y2BaegydF4y2Ba，比较实际(gydF4y2BaygydF4y2Ba轴)和预测(gydF4y2BaxgydF4y2Ba轴)gydF4y2BaBRD9gydF4y2Ba三个TCGA队列的表达水平。每个点对应一个样本。gydF4y2BaρgydF4y2Ba，实际值与预测值之间的斯皮尔曼相关性。gydF4y2BafgydF4y2Ba，中所示的TCGA队列患者样本的RNA-seq读取覆盖图gydF4y2BaegydF4y2Ba中所示的代表性替代拼接事件gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba．每个覆盖图说明了在gydF4y2BangydF4y2Ba= 5例患者样本来自垂直匹配队列gydF4y2BaegydF4y2Ba表现出nmd诱导亚型的最低或最高相对表达。gydF4y2BaμgydF4y2Ba，所示nmd诱导亚型的平均相对表达量，计算每组样本。gydF4y2Ba

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补充信息gydF4y2Ba

补充图1gydF4y2Ba

.未裁剪的凝胶图像呈现在整个论文中。每个未裁剪的凝胶所示的对应图中有一个红框，表示凝胶是如何裁剪以在图中显示的。DNA或蛋白质的梯子出现在侧面。免疫印迹探针在相关情况下有指示gydF4y2Ba

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补充表gydF4y2Ba

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井上，D.， Chew, GL.，刘，B.。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba癌症中非典型BAF复合物的剪接染色体破坏。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba574gydF4y2Ba， 432-436(2019)。https://doi.org/10.1038/s41586-019-1646-9gydF4y2Ba

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