从原始时钟到昼夜节律振荡器gydF4y2Ba

昼夜节律钟是自我维持的生物振荡器，在原核生物和真核生物中普遍存在。在真核生物中，这些系统是复杂和高度复杂的，而在原核生物中，核心机制是由翻译后振荡器调节的，该振荡器可以在体外用ATP和三种蛋白质(由ATP编码)重建gydF4y2BakaiAgydF4y2Ba，gydF4y2BakaiBgydF4y2Ba而且gydF4y2BakaiCgydF4y2Ba）gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．KaiABC系统的开创性工作已经导致了对其生物钟的全面了解。KaiC是通过与KaiA结合而自磷酸化的中心成分，并在与KaiB结合后自去磷酸化gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}．这三种蛋白质之间的相互作用已在体外被证明构成了一个真正的昼夜节律振荡器，其特点是持久性、复位和温度补偿。因此，KaiABC系统被认为是一种优雅且最简单的昼夜节律实现。动物的进化史gydF4y2Ba凯gydF4y2Ba建立基因gydF4y2BakaiCgydF4y2Ba作为最古老的成员，可以追溯到35亿年前。后续增加的gydF4y2BakaiBgydF4y2Ba最近gydF4y2BakaiAgydF4y2Ba形成现存gydF4y2BakaiBCgydF4y2Ba而且gydF4y2BakaiABCgydF4y2Ba集群,分别gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10克ydF4y2Ba}．值得注意的是，一些对更原始生物的研究缺乏gydF4y2BakaiAgydF4y2Ba暗示了gydF4y2BakaiBCgydF4y2Ba基于系统的系统可能已经提供了一个基本的沙漏式计时机制gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba}．与蓝藻中发现的自我维持振荡器相反，这样的计时器需要环境线索来驱动时钟和每天的沙漏翻转。昼夜节律在许多生物过程中的核心作用，由地球上的昼夜周期控制，使它们的进化成为一个迷人的话题。gydF4y2Ba

在这里，我们通过对紫色非硫光合变形菌KaiBC系统的生化和结构研究来研究这样一个原始的生物钟gydF4y2BaR。gydF4y2BasphaeroidesgydF4y2BaKD131(以下，其组分称为KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba)．生物体在体内表现出持续的基因表达节律，但是否gydF4y2BakaiBCgydF4y2Ba是对这一观察结果仍不确定的原因吗gydF4y2BakaiCgydF4y2Ba基因敲除gydF4y2Ba^11gydF4y2Ba．之前对这种密切相关的细菌的研究gydF4y2BaRhodopseudomonas palustrisgydF4y2Ba使用敲除菌株证明了固氮的原始昼夜节律和蛋白表达之间的因果关系gydF4y2BakaiCgydF4y2Ba基因gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba．这里通过体外实验，我们发现KaiBCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba原始的昼夜节律钟与广泛研究的昼夜节律振荡器的机制不同吗gydF4y2Ba聚球藻属elongatusgydF4y2BaPCC 7942(以下，其组件称为KaiAgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba, KaiBgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba和KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba）gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba}．我们发现了一种环境线索，可以调节磷酸化状态，从而在体内产生24小时时钟，作为昼夜之间atp - adp比率的开关。我们的动力学研究结果结合x射线和低温电子显微镜(cryo-EM)相关状态的结构，揭示了一个对沙漏功能至关重要的远程变构途径，并阐明了自维持振荡器的演化。值得注意的是，我们发现了KaiC的一个新的蛋白质折叠gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba并在该系统中发现了一个跨度约115 Å的线圈域的寄存器移位作为关键调节器，这显示出与动力蛋白信号在结构上的相似性gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

来深入了解gydF4y2BakaiBCgydF4y2Ba聚类，我们构建了一个系统发育树gydF4y2BakaiCgydF4y2Ba在gydF4y2BakaiBgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba及补充数据集gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．我们想要回答的第一个问题是KaiC如何gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba分支中的其他成员可以自磷酸化，尽管没有KaiA。已知KaiA在典型KaiABC体系的最佳温度下对这一功能至关重要。我们观察到一个大的分支，它的c端尾巴长了大约50个氨基酸gydF4y2BakaiCgydF4y2Ba在其他演化支(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．A环附近的c端延伸主要出现在gydF4y2BakaiC2gydF4y2Ba亚组，先前被注释为具有两个丝氨酸磷酸化位点，而不是在gydF4y2BakaiC1gydF4y2Ba而且gydF4y2BakaiC3gydF4y2Ba子组gydF4y2Ba^{13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba年代。gydF4y2BaelongatusgydF4y2Ba， KaiA的绑定gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba到KaiC的A循环gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba将它们系在一个暴露的构象中gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba这激活了自磷酸化和核苷酸交换gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba．考虑到延伸的c端尾部与A环的接近性，我们推测它可能作为KaiA出现后多余的“原始”调节部分。gydF4y2Ba

为了验证我们的假设，我们首先测量了KaiC中的自磷酸化和核苷酸交换率gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba，这两者都依赖于KaiA在KaiABC中的存在gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba系统。我们观察到KaiC的自磷酸化率gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba这比KaiC高出约16倍gydF4y2Ba_SEgydF4y2BaKaiA激活gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba(6.5±1.0 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}与0.40±0.02 h相比gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别;无花果。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 a egydF4y2Ba)．同样，KaiC的核苷酸交换速率更快gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与KaiC相比gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba，即使KaiA在场gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba(18.0±1.5 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}相比4.7±0.3 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别;无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．我们的数据表明，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba可以自行进行自磷酸化和核苷酸交换，并且比最近进化的同类更快。gydF4y2Ba

机械地评估KaiC在gydF4y2BakaiAgydF4y2Ba-null系统实现自磷酸化，我们转向结构生物学。KaiC的晶体结构gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与来自蓝藻的KaiC不同，揭示了一种同十二聚体，由两个同六聚体结构域组成，由延伸的c端尾部形成的12螺旋线圈结构域连接(蛋白质数据库(PDB)标识符:gydF4y2Ba8 dbagydF4y2Ba；无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba及扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．对KaiC中CII域的进一步检查gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiCgydF4y2Ba_{SE / TEgydF4y2Ba}（gydF4y2BaThermosynechococcus elongatusgydF4y2BaBP-1即KaiCgydF4y2Ba_TEgydF4y2Ba)在A环取向上有明显差异:KaiC表现为延伸构象gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与KaiC的埋向相比较gydF4y2Ba_{SE / TEgydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．这种扩展构象在KaiA结合后的存在已经被提出gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．这一假设是基于分别在去除A环或破坏KaiA结合后所发生的过度磷酸化和低磷酸化gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba．最近解决了夜间拟磷KaiC的冷冻- em结构gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba-S431E/T432A在压缩状态下直接显示了一个无序的a循环，不再与422循环相互作用gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba，类似于我们在KaiC中观察到的扩展A环构象gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．A环和422环之间相互作用的缺失(距离磷酸化位点仅10个残基)导致Ser431-Thr432的羟基与ATP的γ-磷酸之间更接近，从而促进了磷酸化转移步骤gydF4y2Ba^20.gydF4y2Ba．进一步，KaiC之间的序列相似性gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba对于A环路和被认为对该环路在其埋藏方向上的稳定重要的残基(即422环路和残基438-444)小于30%(图。gydF4y2Ba1 egydF4y2Ba)．总之，我们的结构和动力学数据支持这样一种观点，即暴露的A环是不依赖kaia的核苷酸交换增强的关键，因此在KaiC中发生自磷酸化gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba或者其他基于kaibc的系统。gydF4y2Ba

然后，我们质疑了线圈结构域的目的是“拉起”A环还是积极参与KaiC的核苷酸交换和自磷酸化。为了进一步了解它的作用，我们根据系统发育树和晶体学信息(KaiC)在残基Glu490上进行了截断gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil)(扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)来破坏两个六聚体之间的线圈相互作用。KaiC的晶体结构gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaΔ线圈(PDB:gydF4y2Ba8 db4gydF4y2Ba；无花果。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba及扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，其阻垢色谱图和分析超离心剖面(扩展数据图。gydF4y2Ba3得了gydF4y2Ba)显示无线圈-线圈相互作用的六聚体结构。KaiC在CII域中的核苷酸交换率gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil与野生型蛋白具有可比性(19.1±0.8 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}18.0±1.5 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别;扩展数据图。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba)．磷酸化率也相似(5.5±0.4 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}7.4±0.3 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}对于KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil和野生型分别;扩展数据图。gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba)．这些结果表明，在KaiC中核苷酸交换和自磷酸化中起关键作用的是延长的A环，而不是线圈相互作用gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．该结果还提供了其他基于kaibc的系统中缺乏线圈束的自磷酸化的潜在机制。值得注意的是，线圈束提供了额外的六聚体稳定性。详细来说，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在只有ADP存在的情况下，十二聚体在很长一段时间内是稳定的。gydF4y2Ba3 g hgydF4y2Ba)，而KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba，在这些条件下未观察到低聚物gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

KaiC磷酸化状态的改变已被证实是昼夜节律的中心特征gydF4y2Ba^{22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba}．值得注意的是，当比较全长KaiC的未磷酸化形式时gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(PDB:gydF4y2Ba8 dbagydF4y2Ba)及其拟磷突变体(S413E/S414E;PDB:gydF4y2Ba8 fwigydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba及扩展数据表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，我们观察到两种不同的线圈-线圈相互作用。在磷酸化之后，线圈对通过与对面六聚体的另一个相邻链相互作用来交换伙伴，这导致了沿整个线圈传播约115 Å的寄存器移位(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在拟磷状态下，寄存器包含更大的疏水残基，导致比去磷酸化形式更稳定的相互作用(图。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．进一步研究了KaiC的c端残基gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413E/S414E与对面六聚体的CII结构域相互作用，而野生型结构中最后30个残基缺乏电子密度表明其在去磷酸化状态下具有更强的灵活性。我们发现这些线圈结构域的构象变化似乎是通过一个远程变构网络耦合到磷酸化位点的。当蛋白质被磷酸化或没有磷酸基时，Ser413、Ser414、Trp419、Val421、Tyr436、Leu438、Val449和Arg450残基的旋转互移状态一致地指向核苷酸结合位点(图4)。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．我们认为核苷酸与磷酸化残基的接近促进了更有效的磷酸化转移。因此，我们通过实验确定了线圈结构域对KaiC的自脱磷酸化速率的影响gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．野生型蛋白去磷酸化相对较快(观察速率常数= 11.5±0.8 h)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})在只有ADP存在的情况下。相比之下，KaiC的去磷酸化很少gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δ线圈(无花果。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)，其变构传播被中断(扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．与这种由线圈结构域介导的加速脱磷酸化速率一致，我们的晶体学数据显示KaiC的Ser414上有一个磷酸基gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil但对野生型蛋白没有作用(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

值得注意的是，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba尽管由于其延伸的A环构象而对磷酸化具有组成活性，但它可以自行去磷酸化。在规范中gydF4y2BakaiABCgydF4y2BaKaiB和KaiC之间的相互作用需要提供一个新的结合界面，将KaiA从其激活的结合位点隔离，从而促进机体在最佳温度下的自去磷酸化gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}．因此，我们试图了解KaiC是否gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba系统是否能振荡以及KaiB是否有调节作用gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在这个过程中。比较KaiC的体外磷酸化状态gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaKaiB的缺席和存在gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在KaiB存在的情况下，显示出初始的快速磷酸化，然后是振荡样模式gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(以下简称KaiBC)gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba)，而KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba仅被磷酸化(图;gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．值得注意的是，与KaiB反应过程中ATP的消耗gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba显著高于对照组(图;gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)．如上所述，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在只有ADP存在的情况下，也会完全去磷酸化(图。gydF4y2Ba2 fgydF4y2Ba)．这些结果表明KaiC的磷酸化状态gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和观测到的振荡半周期(图;gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)可能与atp - adp比值的变化有关。我们推测，这可能构成重置计时器的环境线索。为了验证我们的假设，在KaiBC完全去磷酸化后加入atp回收系统gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．正如预测的那样，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba能够重新启动循环并再次磷酸化(扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．我们注意到，在体内，atp - adp比值不会像在体外实验中那样发生显著变化，因为核苷酸稳态受到严格调控。模拟白天和黑夜的周期gydF4y2BaR。gydF4y2BasphaeroidesgydF4y2Ba，我们在保持ATP- adp比例不变的情况下重复实验(白天主要是ATP，由于光合作用，而夜间ATP- adp比例为25:75%)gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba．在高ATP存在的情况下(即模拟白天)，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba保持单或双磷酸化(图;gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)，与KaiB无关gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．相比之下，恒定的25:75%的atp - adp比例(即模拟夜间时间)会导致更高比例的去磷酸化KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2BaKaiB在场gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba)．此外，当atp - adp比值翻转到模拟白天时，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba能够再次磷酸化(图;gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba在28小时左右)。我们的数据支持KaiBC的磷酸化行为gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba强烈依赖于atp - adp比，证明KaiB的物理结合gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结果KaiC水平较高gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在夜间去磷酸化。gydF4y2Ba

接下来我们研究了在KaiC中观察到的加速的atp酶活性gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba复合物形成后。KaiC报告atp酶活性gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba低(大约每天15个ATP分子，每个KaiC分子gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba)，并被认为是昼夜节律振荡缓慢的原因gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba单独表现出明显高于KaiC的atp酶速率gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba，通过与KaiB的结合进一步增强gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(208±19和1557±172 ATP分子每天每KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba分别;在图中留下两个棒。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 c ggydF4y2Ba)．此外,KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba其atp酶活性不表现出温度补偿(温度系数gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_{10克ydF4y2Ba}约为1.9;扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)，这是KaiC中的一个特性gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba并被认为是自我维持节奏的先决条件gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba．偏离统一为gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_{10克ydF4y2Ba}与我们之前的观察相一致，KaiBCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba系统不是一个真正的昼夜节律振荡器，而是一个沙漏计时器(图。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

详细介绍了如何绑定KaiB的机制gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在CI域，变构作用影响KaiC的自脱磷酸化gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在CII领域仍不清楚。有三种可能的情况可以解释这一点:(1)KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结合刺激磷酸化基从pSer转移回ADP(扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba）;(2) KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结合增加了活性位点ATP的水解速率(扩展数据图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）;(3) KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结合加速CII结构域的核苷酸交换(扩展数据图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)．为了区分这些可能性，我们进行了放射性实验来跟踪核苷酸相互转换。我们还测量了野生型KaiC的atp酶活性gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba以及在CI或CII结构域没有atp酶活性的突变形式，并通过测量mant-ATP的荧光来量化核苷酸交换率。首先，我们检测到快速，瞬态gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP-ATP的形成在我们的放射性实验中从gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP-phosphorylated KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba，这是由于其ATP合酶活性在CII结构域(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7罪犯gydF4y2Ba)．观察到的磷酸化转移速率与KaiB无关gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(观察速率常数= 12.0±1.7 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}15.4±1.7 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别在它不在的时候和在它存在的时候;无花果。gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)，与凝胶电泳实验测定的速率(11.0±0.8 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}11.5±0.8 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}有或没有KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba分别;扩展数据图。gydF4y2Ba7 e, fgydF4y2Ba)．我们的实验数据证实了KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba通过ATP合酶机制进行去磷酸化，类似于KaiC的观察结果gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba)．KaiB不会加速实际的磷酸化转移反应，这从来不是限制速率的步骤。由于我们无法在ADP存在的情况下稳定第一个磷酸化位点(Ser414)，这里报道的速率只对应于Ser413的去磷酸化。其次，为了反褶积CI和CII结构域对所观察到的atp酶活性的贡献，我们测量了来自KaiC的ADP产生gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在CI结构域(KaiC)中取消水解的突变体gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-E62Q/E63Q)或CII域(KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-E302Q / E303Q)。野生型KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba， KaiB的结合gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba导致atp酶活性增加7.5倍，这两个结构域都受到影响，并对总体效果产生了附加作用(CI为3倍，CII至少为1.7倍)(图2)。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8罪犯gydF4y2Ba)．值得注意的是，CII结构域的翻倍增加代表了诱导产生KaiC的突变的下限gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-E62Q/E63Q干扰KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba绑定，如前面报道的KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba)．第三，我们对核苷酸交换的测量表明，这个速率也不受KaiB的影响gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结合(19.8±1.8 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}18.0±1.5 hgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}有或没有KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba分别;无花果。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)．由于CI区核苷酸结合位点附近没有色氨酸残留，只能测定CII区交换率。值得注意的是，KaiB存在时，荧光振幅的变化较小gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba，这说明即使KaiB的结合gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba不加速核苷酸交换，它似乎诱导CII结构域的构象重排，特别是在较高的温度下(图。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 f-hgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

阐明KaiC atp酶活性增强的结构基础gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaKaiB后gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结合，我们解决了KaiC的冷冻- em结构gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba独自一人(PDB:gydF4y2Ba8 fwigydF4y2Ba)，并与KaiB复合gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(PDB:gydF4y2Ba8 fwjgydF4y2Ba(扩展数据表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．十二KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba分子(溶液中的单体;扩展数据图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)绑定到KaiC的CI域gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413E/S414E十二聚物gydF4y2Ba4得了gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba)．KaiB的束缚态gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba采用与KaiB相同的折叠开关构象gydF4y2Ba_TEgydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^25gydF4y2Ba)，并提出这是规范的结合胜任态(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．KaiB绑定后gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba时，CI-CI接口松动(图;gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)，从而形成一个隧道，将溶剂本体与活性区水解水的位置连接起来(图2)。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba9 cgydF4y2Ba)．还有其他证据表明CI域内的相互作用减弱。首先,KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba绑定到任意一个KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-CI域(扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)或KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil(即缺少c端扩展;扩展数据图。gydF4y2Ba10 bgydF4y2Ba)导致六聚体KaiC的分解gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结构成单体。相比之下，全长KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与KaiB结合后保持寡聚状态gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba，这可能是由于线圈相互作用提供的稳定。第二，熔化温度降低(gydF4y2BaTgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba)gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaKaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba浓度(扩展数据图。gydF4y2Ba10 cgydF4y2Ba)．邻近的KaiB之间没有相互作用gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba复合物中的分子(扩展数据图。gydF4y2Ba9 bgydF4y2Ba)，说明KaiB存在非合作组装gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba对KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．这个结果与KaiBC观察到的结果相反gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba和KaiBCgydF4y2Ba_TEgydF4y2Ba复合物gydF4y2Ba^{31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

此外，我们注意到KaiC的拟磷变体中存在kaib结合结构gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 c, dgydF4y2Ba)及KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba)在它们的CI域中具有ADP边界。这一结果表明，水解后状态也是KaiB的结合能力状态gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．为了验证这一假设，一个his标记的KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba蛋白被用于下拉实验，以检测其与KaiC野生型和突变型的物理相互作用gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与ADP或ATP结合。几乎所有KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与adp结合的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba，而不到30%以atp结合形式共洗脱，无论磷酸化状态如何(图2)。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba10 d, egydF4y2Ba)．配合物的形成与atp - adp比成反比(扩展数据图。gydF4y2Ba10 fgydF4y2Ba)．我们进行了荧光各向异性竞争实验，以获得更定量的描述KaiC之间的结合相互作用gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．高度相似的解离常数(gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba)的值为未磷酸化的野生型KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)及其拟磷形式(扩展数据图。gydF4y2Ba10克gydF4y2Ba)与ADP结合(分别为0.42±0.03 μ M和0.79±0.06 μ M)。atp结合磷酸化野生型KaiC没有得到可测量的结合曲线gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)或为KaiC服务gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413E/S414E(扩展数据图gydF4y2Ba10克gydF4y2Ba)与atp循环系统，这可能是由于复合物存在的比例较小。我们的数据表明，CI结构域的水解后状态是KaiB的关键gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba而KaiC的磷酸化状态gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba只有边际效应。gydF4y2Ba

总之，我们演示了KaiB的结合gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在解后状态的CI区域，促进KaiC去磷酸化后瞬时形成的ATP的水解gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在CII域(图;gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba)．我们的荧光实验(图;gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 fgydF4y2Ba)检测到KaiB后CII结构域发生构象变化gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结合，但我们没有观察到冷冻- em结构的主要结构变化。基于荧光振幅的温度依赖性(扩展数据图。gydF4y2Ba8 fgydF4y2Ba)，我们推测无法检测构象差异可能是由于温度较低。由于CII域更倾向于结合ATP而不是ADP(扩展数据图)。gydF4y2Ba10 hgydF4y2Ba)， KaiB刺激CII结构域ATP水解gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba尤其重要的是保留KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在夜间处于去磷酸化状态。在此期间，外源性atp - adp比值保持足够高，否则会导致atp在CII活性位点的结合(图2)。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

的KaiBCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba这里研究的系统代表了一种原始的沙漏计时机械，其机制提供了对更进化的昼夜节律振荡器如KaiABC的深入了解。十二元的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba由于其延伸的c端尾部与相反的六聚体形成线圈束，显示出本构激酶活性。这种结构引出了类似于KaiAC中暴露的a环构象gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba，自磷酸化在半小时内发生。在KaiABC中gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba从未磷酸化到双磷酸化的KaiC的转变发生在大约12小时内，并且KaiA的出现完成了昼夜节律的前半段的微调gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba在进化过程中。第二个时钟蛋白KaiB在两个系统中以相同的折叠开关状态结合CI结构域。这种相互作用由KaiABC中的磷酸化状态控制gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba系统，其唯一功能是隔离KaiAgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba而KaiB的结合直接加速了KaiBC中atp酶的活性gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba不管磷酸化状态如何。的KaiBCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba系统需要一个atp - adp浓度的环境开关来重置时钟。因此，当有机体中的核苷酸浓度固有地波动时，系统遵循昼夜时间表。相比之下，自持振荡器KaiABCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba在很宽的核苷酸浓度范围内保持功能，并通过改变其磷酸化周期和振幅来响应atp - adp比率的变化，以保持昼夜循环gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

新报道的KaiC结构褶皱利用了多功能线圈结构作为调节KaiC的远程变构网络的一部分gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba去磷酸化。自然界利用线圈结构域的构象变化来发挥各种调节功能gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba，包括运动蛋白动力蛋白在细胞沿肌动蛋白丝运输货物的活动gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba．类似的寄存器移位，虽然在只有两个螺旋形成的线圈-线圈相互作用中，在动力蛋白运动中使用。考虑到这个简单的七角重复序列出现了多次，并且在生命的所有王国都能找到gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba，这是趋同进化的一个例子。gydF4y2Ba

KaiC和KaiB表达载体的构建gydF4y2Ba

野生型KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(基因库标识符:gydF4y2BaACM04290.1gydF4y2Ba)及KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(基因库:gydF4y2BaWP_002725098.1gydF4y2Ba)gydF4y2BaR。gydF4y2BasphaeroidesgydF4y2Ba菌株KD131/KCTC 12085(等效:gydF4y2BaCereibacter sphaeroidesgydF4y2Ba本文所使用的菌株KD131的结构是从GenScript (Supplementary TablegydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．KaiC的密码子优化质粒gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba亚克隆到pETM-41载体的NcoI/KpnI位点。使用QuikChange II位点定向突变试剂盒(Agilent Technologies)生成单突变体、双突变体和截断型KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．删减后的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil和KaiCIgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba)通过在KaiC中引入停止密码子生成gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba野生型质粒。所有引物均从Genewiz订购(补充表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．目标KaiC的存在gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaGenewiz使用同一公司订购的引物进行DNA测序，确认了质粒中的突变(见补充表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

两个KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba和KaiAgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba质粒是e。K。奥谢。按照先前描述的程序进行表达和纯化gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

KaiC的表达与纯化gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba从gydF4y2BaR。gydF4y2BasphaeroidesgydF4y2Ba

KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba, KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba突变体和KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba表达为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21(DE3)细胞(New England Biolabs)含有pETM-41质粒gydF4y2BakaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba或gydF4y2BakaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba基因。从新制备的转化板上取3个菌落接种到1升含50 μg ml的TB培养基中gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba卡那霉素。培养条件为25°C, 220转/分。48小时无IPTG诱导(渗漏表达)。以4200转/分的离心速度将细胞制成颗粒。在4°C下保存15分钟，并在- 80°C保存。gydF4y2Ba

KaiC冷冻细胞颗粒gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba突变体重悬至裂解液缓冲液(缓冲液AgydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba})含有1× edta不含蛋白酶抑制剂鸡尾酒(赛默飞雪科学公司)，DNAse I (Sigma Aldrich)和溶菌酶(Sigma Aldrich)，裂解物在冰上超声10-15分钟(开20秒，关30秒，输出功率小于40%)，然后在18000转/分离心。在4°C浸泡45分钟，以清除细胞碎片。裂解液经0.45 μm过滤器过滤，然后加载在HisTrap HP预包装的Ni-sepharose柱(Cytiva)上，预平衡缓冲液agydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}0.5 ml mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．用A缓冲液清洗色谱柱gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}1ml mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba直到紫外线吸光度恢复到基线。然后用15%的缓冲液B清洗杂质gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}，用50%缓冲液B洗脱蛋白gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}．洗脱物用1.5倍透析缓冲液稀释gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}然后将内部制备的his标记TEV蛋白酶(1:10,TEVP:KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba摩尔比)去除HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-来自KaiC的mbp标签gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(野生型和突变型)在4°C的6-8 kDa蛇皮透析管(赛默飞世尔科学公司)中过夜，与透析缓冲液交换gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}．裂解KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba经1 μm过滤器过滤，再次以0.5 ml mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba去除His标记的TEV蛋白酶，HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-MBP标记和未裂解蛋白。使用Millipore Amicon Ultra-15离心过滤装置(截止量为10 kDa)对流过的液体进行浓缩，然后立即通过HiPrep Sephacryl S-400 HR柱(Cytiva)，该柱与C缓冲液预平衡gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}．在62.5 kDa的Bis-Tris 4-12%梯度SDS-PAGE凝胶(Genscript)上，用单条带纯化蛋白至均匀性。所有蛋白质纯化步骤均在4°C或冰上完成。在−80°C储存之前，对蛋白质进行搅拌和速冻，直到进一步使用。使用Microplate BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific)在SpectraMax MiniMax 300成像细胞仪上以BSA为标准曲线测量蛋白浓度。典型的KaiC产量gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(野生型和突变型)为20 ~ 40 mg lgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba的文化。gydF4y2Ba

测试纯化后的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba有任何atp酶污染，Q-sepharose HP柱(Cytiva)预平衡缓冲DgydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}在最后的HiPrep Sephacryl S-400 HR列之前使用。用5 CV从0到100%的缓冲液E线性梯度洗脱该蛋白gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}．使用Q-sepharose HP柱纯化的蛋白质样品的atp酶活性与不使用该额外纯化步骤的样品相同。缓冲一个gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}包括50mm Tris-base (pH 7.5)， 250mm NaCl, 10mm咪唑，2mm TCEP, 5mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1mm ATP和10%甘油(v/v)。缓冲BgydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}包括50mm Tris-base (pH 7.5)， 250mm NaCl, 500mm咪唑，2mm TCEP, 5mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1mm ATP和10%甘油(v/v)。透析gydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}包括50mm Tris-base (ph7.0)， 50mm NaCl, 2mm TCEP, 5mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1mm ATP和10%甘油(v/v)。缓冲CgydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}包括50mm Tris-base (ph7.0)， 50mm NaCl, 2mm TCEP, 5mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1mm ATP和10%甘油(v/v)。缓冲DgydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}由50mm Tris-base (ph7.0)， 2mm TCEP, 5mm MgCl组成gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1mm ATP和10%甘油(v/v)。缓冲EgydF4y2Ba_{c - rgydF4y2Ba}包括50mm Tris-base (ph7.0)， 1m NaCl, 2mm TCEP, 5mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1mm ATP和10%甘油(v/v)。gydF4y2Ba

KaiB的纯化gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiC相似吗gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba，但略有修改，如下所示。超声和离心去除细胞碎片后，裂解液经0.22 μm过滤器过滤，然后通过HisTrap HP预填充Ni Sepharose柱，缓冲液a预平衡gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}．用A缓冲液清洗色谱柱gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}直到紫外线吸光度恢复到基线。用5%缓冲液B清洗杂质gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}，用50%缓冲液B洗脱蛋白gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}．用Amicon搅拌细胞(Millipore Sigma)将融合蛋白浓缩至约30 ml，截止时间为10 kDa。加入内部制备的his标记TEV蛋白酶，融合蛋白在3.5 kDa透析盒中4°C裂解过夜，并与透析盒交换gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}缓冲区。裂开的KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba通过HisTrap HP预包装的Ni-sepharose柱，并使用Millipore Amicon Ultra-15离心过滤装置(3.5 kDa截止)浓缩至约10 ml。然后将蛋白质样本加载到26/60 Superdex S75凝胶过滤柱(Cytiva)上，该柱预先与C缓冲液平衡gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}4°C。洗脱后的蛋白质被装载到预先与缓冲液D平衡的Q-sepharose HP柱上gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}去除atp酶污染。蛋白质在流经时被冲洗掉了。从0到100%缓冲E的梯度gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}通过Q-sepharose HP柱，以确保没有KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba被绑在柱子上。在10.3 kDa的Bis-Tris 4-12%梯度SDS-PAGE凝胶上，用单条带纯化蛋白至均一性。在−80°C储存之前，将蛋白质搅拌并快速冷冻，直到使用。使用Microplate BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific)在SpectraMax MiniMax 300成像细胞仪上以BSA为标准曲线测量蛋白浓度。KaiB的典型产量gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba30-40 mg lgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba的文化。gydF4y2Ba

缓冲一个gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}由50mm Tris-base (pH 7.5)， 250mm NaCl, 10mm咪唑，2mm TCEP和10%甘油(v/v)组成。缓冲BgydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}由50mm Tris-base (pH 7.5)， 250mm NaCl, 500mm咪唑，2mm TCEP和10%甘油(v/v)组成。透析gydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}含有50 mM Tris-base (pH 7.5)， 250 mM NaCl, 2 mM TCEP和10%甘油(v/v)。缓冲CgydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}由50mm Tris-base (pH 7.5)， 50mm NaCl, 2mm TCEP和10%甘油(v/v)组成。缓冲DgydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}含有50mm Tris-base (pH值7.5)，2mm TCEP和10%甘油(v/v)。缓冲EgydF4y2Ba_{B-RSgydF4y2Ba}由50mm Tris-base (pH 7.5)， 1m NaCl, 2mm TCEP和10%甘油(v/v)组成。gydF4y2Ba

KaiC的系统发育树gydF4y2Ba

本研究中使用的蛋白质序列经多步鉴定。在第一步中，使用BLASTP算法识别序列的选择，利用基于KaiC的蛋白质序列的查询gydF4y2Ba年代。gydF4y2BaelongatusgydF4y2Ba(基因库:gydF4y2BaWP_011242648.1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba^38gydF4y2Ba．查询在NCBI的非冗余蛋白数据库中运行，排除模型或未培养和环境样本序列。使用MAFFT对所选1538个序列进行多序列比对gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}(补充数据集gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．使用RAxML (v.8.2.9)生成KaiC的初始系统发育树时，将这种比对作为输入。gydF4y2Ba^42gydF4y2Ba使用PROTGAMMALG模型。然后使用生成的树来识别KaiB的出现，以创建最终的树，该树专注于包含KaiBC或KaiABC的系统。为此，对来自的KaiB序列的每个分支尖端执行BLASTP搜索gydF4y2Ba年代。gydF4y2BaelongatusgydF4y2Ba，结果仅限于分枝尖端被鉴定的生物体。KaiB出现的分支点与先前的结果很好地吻合，表明KaiB主要出现在非古菌、非变形菌中gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了确保最好的序列覆盖率，使用KaiB作为查询的BLASTP搜索(GenBank:gydF4y2BaWP_011242647.1gydF4y2Ba)进行。然后用得到的序列来识别它们来自的生物，这使我们能够创建一个具有已识别的KaiB序列的生物列表。然后，该列表用于选择后续使用KaiC作为查询的BLASTP搜索，从而仅识别同时包含KaiB和KaiC的生物的KaiC序列。进行了抽查以确认，例如，KaiA确实在除gydF4y2Ba原绿球藻gydF4y2Ba．使用CD-HIT对所获得的序列进行裁剪，只包括序列同源性为90%或更低的序列gydF4y2Ba^43gydF4y2Ba总共得到401个序列。对于系统发育树的计算，RecA从gydF4y2Ba年代。gydF4y2Ba拉长了gydF4y2Ba被添加为外组。序列用MAFFT比对gydF4y2Ba^{39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba}(补充数据集gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)与E-INS-I算法gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba．然后使用lg替换矩阵，将多序列比对作为输入，使用IQ-TREE (v.1.6.beta5)计算系统发育树gydF4y2Ba^45gydF4y2Ba使用freeRate模型(使用10个类别;LG + R10)gydF4y2Ba^{46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba}．要确定分支支持，需要进行aBayes测试gydF4y2Ba^48gydF4y2BaSH-aLRT测试(20,000次自举重复gydF4y2Ba^49gydF4y2Ba)和超快自举(20,000次自举重复)gydF4y2Ba^50gydF4y2Ba)(补充数据集gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；分支支持顺序:SH-aLRT支持(%)/aBayes支持/超快引导支持(%))。gydF4y2Ba

x射线晶体学gydF4y2Ba

KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil晶体使用96孔Intelli-Plate (102-0001-00, Art Robbins)在291 K通过静滴蒸汽扩散获得。滴液中含0.5 μl结晶液，0.5 μl蛋白10 mg mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba20 mM MOPS pH 6.5, 50 mM NaCl, 2 mM TCEP, 5 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 3 mM ATP和1 mM AMPPCP，并与50 μl溶液在储层中进行平衡。的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结晶溶液由200 mM六水氯化镁，100 mM HEPES pH 7.5和30% (w/v) PEG 400组成。KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil晶体使用200 mM醋酸铵，100 mM柠檬酸钠三基二水pH 5.6和30% (w/v) PEG 4000生长。gydF4y2Ba

KaiC中的peg400gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结晶液为低温保护剂，KaiC为低温保护剂gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil晶体被低温保护在LV低温油(MiTeGen)。单晶在液氮中冷却，在100 K的ALS光束线8.2.1处采集x射线衍射图像(数据收集详见扩展数据表)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．数据被索引并集成到iMosflm中gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba，并在Aimless进行了扩展和合并gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

得到KaiC的结构模型gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba首先是KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在MRage中通过分子置换解决-Δcoil结构gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba使用KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba序列(残基1-490)作为输入，在PDB数据库中搜索同源词。最初的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba基于KaiC的-Δcoil结构gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba(PDB:gydF4y2Ba1 tf7gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba))是手动重建在Coot (v.0.9.81)gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba并在Phenix中进行了改进(v.1.20.1-4487)gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba．最后是KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在Phaser中使用-Δcoil结构作为分子替换搜索模型gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba来求解全长KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结构。gydF4y2Ba

分配的空间组在Zanuda中得到验证gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba，并用Achesym对非对称单元在单位细胞中的位置进行标准化gydF4y2Ba^58gydF4y2Ba．KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba使用SamCC-Turbo (v.0.0.2)分析线圈寄存器，默认套接字截止值为7.4。gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba)．蛋白质结构图像使用PyMOL (v.2.6.0)进行渲染gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

隧道检测计算采用CAVER 3.0.2 PyMOL插件进行gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba，最小探测半径在0.9 ~ 1.1之间变化。所有其他参数都使用默认值。除了水，所有的原子都被用于计算。起点残基选择为Glu62、Glu63和ADP602。水在CI域中的催化位置由过渡态模拟束缚F的晶体结构模拟gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba腺苷三磷酸酶(PDB:gydF4y2Ba1 w0jgydF4y2BaD链中的2064水gydF4y2Ba^62gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

低温电子显微镜和图像处理gydF4y2Ba

用于制备EM网格，3-4 μl为4.3 mg mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba(每单体浓度)样品在20 mM MOPS pH 6.50, 50 mM NaCl, 2 mM TCEP, 10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba2 mM ATP应用于发光放电1.2/1.3 400目c平碳涂层铜网格(Protochips)。网格使用Vitrobot Mark IV (ThermoFisher)在4°C和95%湿度下冷冻，印迹时间为4秒。所有数据集都是在一个加速电压为300 keV的Titan Krios上收集的，有一个GIF量子能量滤波器(Gatan)和一个由SerialEM控制的Gatan K2 Summit直接电子探测器gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对原始冷冻em图像的检查显示，十二聚体粒子的单个六聚体之间的相对取向存在一些异质性，可能是由于线圈区域的固有灵活性，这将分辨率限制在3.3-3.4 Å。为了获得更高分辨率的重建，十二聚体被拆分并作为单独的六聚体处理，使用gydF4y2BaCgydF4y2Ba6对称应用于整个处理过程。为了重建完整的十二聚体重构，使用Chimera中的“fit in map”功能，将六聚体重构的两个副本相互叠加gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba使一个六聚体与另一个六聚体的低分辨率端密度相匹配。然后将重叠的六聚体组合在一起，创建一个新的映射，其中每个体素从具有最高绝对值的六聚体中获取值。gydF4y2Ba

对于KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413E/S414E单独收集了大约2500部电影的数据集。这些电影的像素大小为1.074 Å，包括70帧，曝光率为1.31 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba每一个gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba每帧。大约825,000个粒子被挑选出来，在二维分类后，大约320,000个来自良好等级平均的粒子被继续进行进一步处理。重建的最终测量分辨率为2.9 Å(扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对于KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413E / S414E: KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba复杂，收集了大约2000部电影的数据集。这些电影的像素大小为1.023 Å，包括70帧，曝光率为1.35 egydF4y2Ba^−gydF4y2Ba每一个gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba每帧。大约44万个粒子被挑选出来，在二维分类之后，大约19万个来自良好等级平均的粒子被继续进行进一步处理。重建的最终测量分辨率为2.7 Å(扩展数据图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

所有数据处理均使用gydF4y2Ba独联体gydF4y2BaTEM (v.2.0.0)gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba，并遵循了运动校正、CTF参数估计、粒子选取、二维分类、从头算三维地图生成、三维细化、三维分类、每个粒子CTF细化和b因子锐化的工作流程。对于两次重建，使用的最高3D细化分辨率为4 Å，最终分辨率使用gydF4y2Ba独联体gydF4y2BaTEM PartFSC的阈值为0.143。gydF4y2Ba

为了验证组合的十二聚体结构，我们还将两个数据集处理为完整的gydF4y2BaDgydF4y2Ba6个对称十二聚体(扩展数据图。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba)．这是通过将拾取的六聚体提取到一个大盒子大小，并执行带有自动居中的2D分类来实现的。然后从原始图像中选择并重新提取清晰的十二聚体类平均值，并通过所需的平移调整坐标以匹配居中类平均值。在此居中之后，重复的选择被移除，以获得最终的十二聚体粒子堆栈。这些堆栈的处理如上所述，3D细化的最高分辨率为4.25 Å。gydF4y2Ba

试图找到偏离gydF4y2BaDgydF4y2Ba6对称性，我们也计算重建的两种结构假设gydF4y2BaCgydF4y2Ba1对称性，从从头算3D步骤开始。由此产生的细化gydF4y2BaCgydF4y2Ba1结构未表现出可检测到的偏离D6对称性(扩展数据图。gydF4y2Ba4 egydF4y2Ba)．因此，我们将对称的体积作为我们的最终结果。gydF4y2Ba

使用KaiC构建了低温电镜结构gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba通过x射线晶体学和折叠开关稳定的KaiB得到的模型gydF4y2Ba_TEgydF4y2Ba(PDB:gydF4y2Ba5 jwogydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba)作为起点。模型是使用Coot (v.0.9.81)构建的。gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba，并使用Phenix (v.1.20.1-4487)进行细化gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

未磷酸化KaiC的制备gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba

纯化KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(约20 μM)在- 80℃条件下，在20 mM MOPS (pH 6.5)， 50 mM NaCl, 2 mM TCEP, 10 mM MgCl中透析gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和0.1 mM ADP过夜，在4°C去除甘油，用ADP代替ATP。透析后的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba然后在30°C加热4小时，得到完全未磷酸化的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与ADP结合，样品通过0.22 μm Spin-X离心管过滤器(康宁)。样品在4℃下被浓缩到更高的浓度(小于100 μM)。蛋白浓度用BCA法测定。gydF4y2Ba

体外KaiBCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba反应gydF4y2Ba

KaiC动力学gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaKaiB存在和不存在时的自磷酸化gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba

磷酸化KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM，如上所述制备)gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM和35 μM)在20mm MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP、10 mM MgCl中预培养1 hgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和0.1毫米ADP。反应开始时，加入3.9 mM ATP，以获得最终浓度为4 mM的核苷酸，存在2 U mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba丙酮酸激酶(Millipore Sigma)和10 mM磷酸烯醇丙酮酸(Millipore Sigma)在反应过程中再生ATP。反应样品在特定时间点手工采样，并与等量负载染料(原液浓度0.1 M Tris-base (pH 7.5)， 4% SDS, 0.2%溴酚蓝，30%甘油和0.5 M 2-巯基乙醇)混合。然后将混合样品存储在−20°C，直到进一步使用。gydF4y2Ba

KaiC动力学gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaKaiB存在和不存在时的自去磷酸化gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba

纯化KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(20 μM左右)在含有20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP、10 mM MgCl的反应缓冲液中透析gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和0.1 mM ADP在4°C过夜以去除甘油并生成KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与ADP结合。4°C透析后，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba存在于两种状态:50%未磷酸化和50%单磷酸化Ser413 (pSer413)，这是由串联质谱证实的(数据未显示)。加入KaiC启动自脱磷酸化反应gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba或KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2BaKaiB在场gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM)进入30°C预平衡的反应缓冲液。gydF4y2Ba

KaiBC振荡gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba

透析KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM)在20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP、10 mM MgCl中，35°C预培养30 mingydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和0.1 mM ADP的存在或不存在KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5μM)。加入4 mM ATP开始反应，在特定时间点收集反应样品进行10% SDS-PAGE和HPLC分析，以确定KaiC的磷酸化状态gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和每个时间点的核苷酸数量。gydF4y2Ba

控制atp - adp比值，模拟白天和夜晚的时间gydF4y2Ba

KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在含有20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP、10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和1mm ATP在4°C过夜。启动如图所示的反应。gydF4y2Ba3 cgydF4y2Ba, KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM)gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM)与额外的ATP(最后4 mM以模拟白天)混合，将反应样品(500 μl)添加到d管透析仪(midi 3.5 kDa cut, EMD Millipore)中，与4 mM ATP缓冲液(400 ml)交换。在12小时时间点后，将反应样品转移到预培养的25% ATP/ADP缓冲液(400 ml)中，模拟夜间时间。24 h时间点后，同样的样品换入预孵育的4 mM ATP，再次模拟白天。gydF4y2Ba

开始实验，如图扩展数据图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba, KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(35 μM)在3mm ATP存在的20 mM MOPS (pH 6.5)， 50 mM NaCl, 2 mM TCEP和10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在35°C加热25分钟以产生完全磷酸化的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba然后将样品稀释10倍到30°C预平衡的25% ATP/ADP缓冲液中，直至KaiC的最终浓度gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM)和KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM或35 μM)。反应样品(300 μl)加入d管透析仪(midi 3.5 kDa cut, EMD Millipore)中，与25% ATP/ADP缓冲液(300 ml)交换。gydF4y2Ba

反应过程中，在30°C培养箱中轻摇样品，在特定时间点收集反应样品进行10% SDS-PAGE和HPLC分析，以确定KaiC的磷酸化状态gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba以及每个时间点的核苷酸数量。gydF4y2Ba

日间和夜间atp - adp比值的理论依据来自于两个早期的文献报告。在该菌株体内直接测定日间和夜间atp - adp比值的变化gydF4y2BaR。gydF4y2BasphaeroidesgydF4y2Ba^27gydF4y2Ba，其中ATP白天为2.0-2.4 mM，夜间下降到0.5-0.6 mM，总核苷酸浓度保持恒定，这是众所周知的。我们在体外实验中选择了4 mM的总核苷酸浓度，以与典型KaiC的体外实验相同gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba．由于在日光下进行光合作用，几乎所有的核苷酸都是ATPgydF4y2Ba^33gydF4y2Ba．我们注意到稍微高一点的ATP量不会影响我们的结果，因为KaiC的亲和力gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaATP的含量高于ADP。gydF4y2Ba

分离未磷酸化、单磷酸化和双磷酸化的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba通过sds - pagegydF4y2Ba

未磷酸化、单磷酸化和双磷酸化KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba以35:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺(Bio-Rad)， 18 cm × 16 cm × 1 mm Tris-HCl凝胶，1× tris -甘氨酸SDS运行缓冲液(Invitrogen)， 10% SDS - page分离。样品在95°C下加热3分钟，400 ng材料加载到Tris-HCl凝胶上。使用Hoefer SE600电泳仪，在冷室中用35 mA, 150 W的恒流，700v以上的电压运行凝胶5.5小时，水浴温度设置为12°C。gydF4y2Ba

未磷酸化和磷酸化KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil由ZngydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}含有50 μM Phos-tag丙烯酰胺(Wako)的10%丙烯酰胺凝胶的Phos-tag SDS-PAGE。凝胶在30 mA恒电流下在冷室中运行5 h 30 min，每孔1 μg蛋白样品在95°C下预热3 min。gydF4y2Ba

凝胶在室温下用InstantBlue蛋白凝胶染色剂(Expedeon)染色过夜，轻轻摇动，用蒸馏水染色，直到清晰可见条带。凝胶在ChemiDoc成像仪(Bio-Rad)上成像，并使用Image Lab软件(Bio-Rad)进行分析。gydF4y2Ba

凝胶电泳的统计和重现性gydF4y2Ba

正文图和扩展数据图中显示的数据是至少三个独立生物重复的代表性SDS-PAGE凝胶(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)，除图中实验外。gydF4y2Ba3 a, cgydF4y2Ba，一式两份。gydF4y2Ba

KaiC的寡聚态gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba

凝胶过滤色谱法gydF4y2Ba

KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba，未磷酸化KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和所有的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba以0.2 ml min加载浓度为40 ~ 80 μM的突变体gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba到预包装Superdex-200 10/300 GL (GE Healthcare)上，预平衡20 mM MOPS (pH 6.5)， 50 mM NaCl, 2 mM TCEP, 10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和1 mM ATP (0.1 mM ADP为未磷酸化的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba)在4°C下使用ÄKTA Pure系统(GE Healthcare)。KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(0.5 mM)加载到Superdex-75 10/300 GL (GE Healthcare)上，在4°C下与20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl和2 mM TCEP预平衡。以每1ml的馏分收集洗脱液并进行SDS-PAGE分析。使用分子量蛋白标准品(Bio-Rad)在相同的缓冲液和流速下运行，确定色谱柱的标准曲线(即分子量与洗脱时间的关系)。蛋白质标准混合物含有甲状腺球蛋白(670 kDa)， γ-球蛋白(158 kDa)，卵白蛋白(44 kDa)，肌红蛋白(17 kDa)和维生素BgydF4y2Ba_12gydF4y2Ba(1.35 kDa)。gydF4y2Ba

分析超速离心法gydF4y2Ba

沉降速度离心实验在50,000转/分进行。(KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba)和30,000 r.p.m(为KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba野生型和突变体以及KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba)，在贝克曼Optima XL-A (Beckman- coulter)上，在20°C下，以0.005厘米的间隔连续扫描5.8至7.3厘米，配备吸收光学系统和四孔An60Ti转子。测量设置在280 nm (KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba)和295 nm(用于KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba)以避免ATP的干扰。数据评价采用软件包SEDFIT (v.14.1)gydF4y2Ba^{66gydF4y2BagydF4y2Ba}．KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba和KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-Δcoil (100 μM)用20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP、10 mM MgCl制备gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和1mm ATP。KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba在20 mM MOPS (pH 8.0)、150 mM NaCl、2 mM TCEP、5 mM MgCl中制备(100 μM)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，和1mm ATP。KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl和2 mM TCEP中制备(500 μM)。gydF4y2Ba

腺苷三磷酸酶活性gydF4y2Ba

纯化KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(野生型和突变型(约20 μM))和KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(约90 μM)在20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP、10 mM MgCl中透析gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和1mm ATP(反应缓冲液)在4°C过夜。样品通过0.22 μm Spin-X离心管过滤器，在反应前用BCA法测定浓度。典型KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba或KaiBCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba反应中含有3.5 μM KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(野生型和突变体)和3.5 μM KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在反应缓冲液中，最终浓度为4 mM ATP。样品在指定的温度下孵育，并在特定的时间点手工采样。取10 μl样品，用10 μl 10%三氯乙酸(Millipore Sigma)淬灭，混合物经0.22 μm Spin-X离心管过滤器去除沉淀蛋白。然后通过添加10 μl 0.75 M HEPES (pH 8.0)重新调整样品的流量至pH 6.2进行核苷酸分离。最终样品保存在−20°C，直到HPLC分析。gydF4y2Ba

用高精度自动进样器(进样误差<0.1 μl，导致最大系统误差约6%)将各3微升样品注入反相高效液相色谱仪，该仪器具有ACE粒径为5 μm, C18-AR和100 Å孔径柱(Advanced Chromatography Technologies)。仪器预平衡100mm磷酸钾pH 6.2，流速0.4 ml mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba．用纯核苷酸样品测定ATP、ADP和AMP的保留时间分别为2.6、3.1和4.4 min。各核苷酸的浓度由峰面积与总核苷酸浓度的相对比值计算。为了确定atp酶活性速率，使用初始速率分析和最小二乘线性回归从每个温度的至少五个数据点确定观测到的速率常数(扩展数据图。gydF4y2Ba6 c, dgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8罪犯gydF4y2Ba)．其平均值和不确定性(s.d.)如图所示。gydF4y2Ba3 dgydF4y2Ba，扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8gydF4y2Ba由三次重复实验得出。KaleidaGraph (v.4.5.3;Synergy)用于数据分析和绘图。gydF4y2Ba

核苷酸交换gydF4y2Ba

KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(野生型或突变体)和KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba透析成20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP、10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba50 μM ATP放置4℃。样品通过0.22 μm Spin-X离心管过滤器，采用BCA法测定蛋白浓度。反应中KaiC的含量为3.5 μMgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413E和/或35 μM的KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba，样品在20、25、30和35℃下在atp回收系统中孵育16-24小时。通过添加250 μM的mant-ATP (Jena Bioscience)开始反应。利用KaiC中色氨酸残基的荧光能量转移来测量光谱gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba通过在290 nm (2.5 nm带宽)激发样品并收集从320 nm到550 nm (5 nm带宽)2 nm增量的发射强度，将样品转化为mant-ATP。为了测量核苷酸交换率，荧光强度在440 nm处的最大变化(ΔgydF4y2BaFgydF4y2Ba_{440海里gydF4y2Ba})，在FluoroMax-4荧光光谱仪(Horiba Scientific)上使用抗光漂白模式，以15秒为增量跟踪1800秒的总时间，并配备水浴以控制温度。在KaiCII的核苷酸结合位点5 Å内有两个色氨酸残基gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在KaiCI的核苷酸结合位点附近没有色氨酸残留gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba因此，实验中观察到的核苷酸交换是针对KaiCII的gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba域。确保实验中观察到的交换速率均来自于核苷酸交换中的KaiCIIgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba域,KaiCIgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(仅包含CI域)进行了测试;添加mant-ATP后荧光没有变化(扩展数据图)。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

KaiC的实验gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba单独和KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba和KaiA混在一起gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba以类似的方式进行，除了KaiCgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba和KaiAgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba在20mm MOPS (ph8.0)， 150mm NaCl, 2mM TCEP, 10mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba50 μM ATP放置4℃。KaiAgydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba与KaiC一起孵化gydF4y2Ba_SEgydF4y2Ba加入250 μM mant-ATP后，在30℃下静置1 h。gydF4y2Ba

核苷酸偏好实验，KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413E/S414E和KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413A/S414A在20 mM MOPS (pH 6.5)， 50 mM NaCl, 2 mM TCEP, 10 mM MgCl中透析gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba20 μM ADP在4℃下过夜。KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-S413E/S414E或KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba首先将-S413A/S414A (3.5 μM)与mant-ATPγS或mant-ADP (150 μM)混合，在30℃下，在440 nm处记录动力学迹。在440 nm处的荧光迹迹达到一个平台后，这表明核苷酸类似物完全与蛋白质结合，加入27倍过量的ATP (4 mM)来取代结合的核苷酸类似物，并在30°C下记录440 nm处荧光强度的衰减。实验进行了三次，结果被平均，并适合于一个单一的指数衰减。gydF4y2Ba

通过使用KinTek Explorer软件将单个痕迹拟合到指数方程中进行分析gydF4y2Ba^{67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba)gydF4y2Ba}，误差柱为三次重复实验所得的标准误差。KaleidaGraph (v.4.5.3;Synergy)用于数据绘图。gydF4y2Ba

^32gydF4y2BaP-ATP放射性标记及实验gydF4y2Ba

^32gydF4y2BaP-labelled KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba通过混合未磷酸化的KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba0.46 μM [γ-gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP]ATP (3000 Ci mmolgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba， PerkinElmer)和500 μM ATP在20mm MOPS (pH 6.5)， 50mm NaCl, 2mm TCEP和10mm MgCl中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在35°C下30分钟，然后立即切换到4°C，以防止KaiC的去磷酸化gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．的gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP-labelled KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba样品通过Zeba自旋脱盐柱(赛默飞世尔科学公司)，预平衡20 mM MOPS (pH 6.5)， 50 mM NaCl, 2 mM TCEP和10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba2次，4°C。样品与含有1mm ADP的缓冲液在4℃孵育过夜，得到gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP-labelled KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba与ADP结合。样品通过最终的Zeba脱盐柱，预平衡20 mM MOPS (pH 6.5)， 50 mM NaCl, 2 mM TCEP和10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba然后在KaiB存在或不存在的情况下，将溶液与8mm ADP孵育gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba4°C 1小时。然后用20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP和10 mM MgCl稀释样品gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在30°C预孵育，以获得的最终浓度gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP-labelled KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(5 μM)， KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(20 μM)和ADP (4 mM)。反应在30℃下孵育，在不同时间点取等分(1.5 μl)。加入1.5 μl Laemmli样品缓冲液(62.5 mM Tris (pH 6.8)， 2% SDS, 25%甘油，0.01%溴酚蓝)和5% (v/v) 2-巯基乙醇，停止反应。gydF4y2Ba

样品放在薄层色谱板(pei -纤维素F板，Merck)上，用吹风机快速干燥30秒。TLC板首先以蒸馏水作为流动相运行。TLC板完全干燥后，0.75 M KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}是否用作流动相分离gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP-labelled KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba,(γ-gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP]ATP和无机磷酸盐(gydF4y2Ba^32gydF4y2BaP)，如前所述gydF4y2Ba^29gydF4y2Ba．磷屏在Amersham Typhoon (GE Healthcare)上以100 μm的分辨率进行扫描。采用ImageQuant TL 7.0软件进行分析。gydF4y2Ba

荧光各向异性竞争gydF4y2Ba

荧光各向异性竞争实验在30°C下使用FluoroMax-4荧光光谱仪(Horiba Scientific)进行。KaiB的激发波长和发射波长gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba用6-碘乙酰氨基荧光素(6-IAF，赛默飞世尔科学公司)标记的Cys29分别设置在492 nm (5 nm带宽)和520 nm (5 nm带宽)，G因子(KaiB的G因子)固定gydF4y2Ba_{RS -gydF4y2Ba}仅iaf)来消除仪器偏差。计算了10次重复测量的平均各向异性和标准误差。gydF4y2Ba

KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba将脱气后的KaiB混合制备-6IAFgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(100 μM)，在20mm Tris-base (ph7.0)， 50mm NaCl和1mm TCEP(脱气)中加入20倍的6-IAF (50% DMSO中10 mM原液)。反应在室温下孵育4小时，然后在3.5 kDa透析盒中与20 mM Tris-base (pH 7.0)、50 mM NaCl和1 mM TCEP在4℃下透析过夜，以去除未反应的6-IAF和少量DMSO。交联样品通过0.22 μm的自旋- x离心管过滤器，加载到Superdex-75 10/300 GL上，预平衡20 mM MOPS (pH 7.0)， 50 mM NaCl和1 mM TCEP, 0.2 ml mingydF4y2Ba^1gydF4y2Ba去除剩余未反应6-IAF的流速。样品在液氮中闪冻并在−80°C保存直到使用。所有交联反应都是在黑暗中进行的。gydF4y2Ba

对于荧光各向异性竞争结合实验，KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-6IAF (0.2 ~ 0.4 μM)首先与野生型或突变型KaiC孵育gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(1 μM，各向异性比KaiB提高60%gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-6IAF单独)20 mM MOPS (pH 6.5)， 50 mM NaCl, 2 mM TCEP和10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在存在4mm ADP或4mm ATP的ATP回收系统(2u mlgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba丙酮酸激酶和10 mM磷酸烯醇丙酮酸)，然后是未标记的KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba样品中加入(0 ~ 50 μM)。样品在30°C下孵育4小时或12小时后测量。gydF4y2Ba

荧光各向异性(FA)随未标记KaiB浓度的降低gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba拟合方程(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)利用KaleidaGraph (Synergy Software)中包含的Levenberg-Marquardt非线性拟合算法，得到半最大抑菌浓度(ICgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba)值。的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_dgydF4y2Ba值即可从集成电路中计算gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba计算公式(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，如上文所述gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

下拉化验gydF4y2Ba

下拉实验探讨了KaiC之间的相互作用gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(野生型和突变体)gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(他gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-MBP-TEV-KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba)．他的gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-MBP-TEV-KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba按照上述方法进行表达和纯化，但不进行TEV蛋白酶裂解步骤。野生型或突变型KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba(3.5 μM)与KaiB混合gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba-标签(3.5 μM)在20mm MOPS (pH 6.5)， 50mm NaCl, 2mm TCEP和10mm MgCl中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以4mm ADP或4mm ATP存在，ATP再循环系统，最终体积为400 μl。样品在25℃下孵育4小时或24小时，然后加载到500 μl的旋转柱上，加入200 μl(从400 μl 50%浆液中制备)与样品缓冲液预平衡的Talon珠(Takara)。样品与Talon珠一起孵育30分钟，轻轻摇晃，之后通过重力收集到1ml Eppendorf管中。用400 μl样品缓冲液重力洗涤3次，然后用200 μl 0.5 M咪唑缓冲液1000离心洗脱gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟。蛋白质混合物、流经、洗涤和洗脱样品在带有分子量标记的Bis-Tris 4-12%梯度SDS-PAGE凝胶上运行。凝胶用考马斯蓝染色，并在ChemiDoc成像仪(Bio-Rad)上成像。图像实验室软件(Bio-Rad)进行分析。gydF4y2Ba

对照实验:(1)融合KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba蛋白在缺乏KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba；(2) KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在没有融合KaiB的情况下gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba．所有的融合KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在第一个对照实验中，只有洗脱缓冲液中出现蛋白，这表明融合KaiBgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba结合魔爪珠和KaiB的数量gydF4y2Ba_RSgydF4y2BaUsed没有使列过载。所有KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba在第二次对照实验中，蛋白在流动通道中流出，说明KaiC与KaiC之间没有特异性结合gydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba还有魔爪珠子。gydF4y2Ba

Thermofluor化验gydF4y2Ba

KaiCgydF4y2Ba_RSgydF4y2Ba最终浓度分别为3 μM和10×的SYPRO Orange (Thermo Fisher Scientific)。实验在20 mM MOPS (pH 6.5)、50 mM NaCl、2 mM TCEP、10 mM MgCl中进行gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba4毫米ADP或ATP。样品在MicroAmp Fast Optical 96孔反应板(Applied Biosystems Life Technologies)中制备至最终体积为20 μl，并用Axygen UltraClear密封膜(Corning)密封。检测板在StepOne Real-Time PCR仪(Applied Biosystems Life Technologies)中运行，并建立熔体曲线。温度从25°C持续升高到95°C，每15 s增加0.3°C。数据在KaleidaGraph (Synergy Software)中进行非线性拟合，拟合为玻尔兹曼s型曲线(方程(gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba))。gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2BaYgydF4y2Ba温度下的荧光强度是多少gydF4y2BaTgydF4y2Ba，gydF4y2BaTgydF4y2Ba为温度，单位为摄氏度，Bottom为低温下的基线荧光，Top为截断数据顶部的最大荧光，gydF4y2BacgydF4y2Ba曲线的斜率或陡度，和gydF4y2BaTgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba是蛋白质的熔化温度。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba