超快的结构变化指导视觉的第一个分子事件gydF4y2Ba

视紫红质是脊椎动物微光视觉的受体，集中在视网膜杆状细胞的盘膜内。视紫红质通过构象变化，激活细胞内G蛋白转导(Gi/o/t家族的一员)，将光的吸收转化为生理信号——启动信号级联，导致电脉冲发送到大脑，最终导致视觉感知。视紫红质的结构由7个跨膜α-螺旋和一个11-组成gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba视网膜发色团通过质子化席夫碱(PSB)共价结合到Lys296gydF4y2Ba^{7.43gydF4y2Ba}(含有TM结构域位置的氨基酸的上标值参考Ballesteros-Weinstein方案，在《TM7》的“残留编号”部分解释gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．与许多A类GPCRs相似，这种埋藏的配体位于细胞外侧的TM束内。视网膜还接触细胞外环2 (ECL2)，它在发色团上形成一个盖子，并包含一个高度保守的二硫化物桥(Cys110)gydF4y2Ba^{3.25gydF4y2Ba}-Cys187gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba})连接到中心螺旋TM3(见参考文献框1)。gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)．Glu113gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba}提供一个带负电荷的反离子gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba与PSB形成盐桥(图;gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba)，从而参与受体静息状态的稳定gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba．从我们对视觉色素进化的理解gydF4y2Ba^{6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba}，我们知道，原来是Glu181gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}是唯一能中和希夫碱正电荷的残留物。这个“祖先的对位”gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba在无脊椎动物中，它仍然是一种复杂的反离子gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba，仍然通过水介导的氢键网络连接到脊椎动物视紫红质的PSB(图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)．第二，主反离子Glu113gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba}在进化过程中出现，这两个残基对激活机制都很重要。低温捕获光激活视紫红质的结构gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba}、Meta II晚期活性态结构gydF4y2Ba^{11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba}，以及丰富的计算gydF4y2Ba^14gydF4y2Ba、生化和光谱研究gydF4y2Ba^{15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba}对视紫红质信号转导机制有重要的认识。然而，需要同时提供高空间和时间分辨率的方法来获得从飞秒到毫秒的原子尺度上的激活机制的完整实验推导图像。gydF4y2Ba

近年来，时间分辨晶体学gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba}在x射线自由电子激光器(XFEL)中已经被用于揭示肌红蛋白的超快结构变化gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba，光活性黄色蛋白gydF4y2Ba^{20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba}，荧光蛋白gydF4y2Ba^22gydF4y2Ba，细菌光敏色素gydF4y2Ba^23gydF4y2Ba，微生物质子gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba}、钠gydF4y2Ba^26gydF4y2Ba和氯gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba泵是细菌的光合反应中心gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba还有非光感蛋白，外源添加的非天然光笼配体gydF4y2Ba^{29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba}．在时间分辨序列飞秒晶体学(TR-SFX)中，晶体中的蛋白质分子用光学激光脉冲光激活，结构在指定的时间延迟后用XFEL的x射线脉冲探测。由于每个晶体产生一个衍射图案，实验以连续的方式进行:帧是从数万个随机定向的晶体中收集的。TR-SFX方法是光谱方法的补充，揭示了飞秒域原子水平的结构细节，而不直接解决电荷效应、氢键相互作用和电子变化。原子分辨率的代价是不太清楚的照明条件gydF4y2Ba^31gydF4y2Ba，这些都是有待讨论的问题gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}更详细的系统研究正在进行中gydF4y2Ba^33gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在这里，我们在室温下使用TR-SFX来跟踪反向激动剂11-的光诱导转换gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba视网膜到激动剂全部gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba在脊椎动物视蛋白中。我们的观察揭示了这是如何转化为蛋白质中的早期结构变化的。1秒后，我们观察到一个扭曲的视网膜储存能量，而蛋白质的结构运动辐射作为一个各向异性的传播远离视网膜发色团。视紫红质结构，100 ps后，显示出稍微宽松的构象。gydF4y2Ba

在非活性暗态下的室温SFX结构以1.8的分辨率获得Å(扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(暗态))来自生长在脂质立方相(LCP)中的微晶体。与从lcp生长的晶体中确定的大多数膜蛋白结构一样，这些晶体显示I型晶格gydF4y2Ba^34gydF4y2Ba通过疏水相互作用形成蛋白质二维层的堆叠(扩展数据图。gydF4y2Ba1得了gydF4y2Ba)．视紫红质分子的潜在生理相关二聚体gydF4y2Ba^35gydF4y2Ba在每个单体的TM1和螺旋8 (H8)段之间形成接触，并以从头到尾的方式组装，生成不对称单元。通过仔细检查衍射数据和得到的电子密度图，发现了平移相关晶体畴的存在。为此，对测量强度进行了修正，在全球范围内提高了地图的质量和可解释性gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba（gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba扩展数据图gydF4y2Ba1 d - igydF4y2Ba及扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．总的来说，SFX结构在非活性暗状态的视紫红质(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)与在低温下收集的其他晶体结构非常相似(例如蛋白质数据库(PDB))。gydF4y2Ba1 gzmgydF4y2Ba；均方根偏差= 0.33 Å在CgydF4y2Ba_αgydF4y2Ba原子)gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba．与早期在低温条件下解决的结构相比，目前的室温结构揭示了所有先前描述的功能和结构水分子的电子密度。这些包括围绕原始反离子Glu181及其极性酪氨酸笼的水介导的簇。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)，它们在随后的光激活过程中起作用gydF4y2Ba^{38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba}．此外，在连接近端反离子Glu113的席夫碱附近，还分解出一个新的有序水分子gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba}对Met86gydF4y2Ba^{2.53gydF4y2Ba}(无花果。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)和Ala117gydF4y2Ba^{3.32gydF4y2Ba}．这种交互在TM包中的TM2-TM3-TM7接口中处于中心位置。gydF4y2Ba

视紫红质的第一亚稳中间体(bathorhodopsin, Batho-Rh)gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba}光活化后200秒产生。它被∆填满gydF4y2BatgydF4y2Ba= 1 ps(参考。gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba41gydF4y2Ba})并持续数十纳秒gydF4y2Ba^{42gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba}．为了描述bath - rh的结构，我们收集了瑞士和日本XFELs的TR-SFX数据(扩展数据图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)来自lcp生长的视紫红质微晶体，在激光诱导加热较低的情况下被光激活(扩展数据图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)，在其中我们恢复了高质量的电子密度差图低于最大激活(扩展数据图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)，使用480 nm波长的飞秒泵浦激光器对∆的光激活进行了三次延迟gydF4y2BatgydF4y2Ba= 1ps, 10ps和100ps。高质量的TR-SFX数据(扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)表示为图中的差分傅里叶电子密度图。gydF4y2Ba2 a, bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．对于较短的时间延迟，电子密度的变化以高度各向异性的方式分布，聚集在埋藏的视网膜发色团附近，并通过TM5和TM6螺旋向蛋白质的细胞质侧传播(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，最低速度为18 Å psgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}沿TM6测量(1800米)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，在水中略高于声速，在核糖核酸酶A晶体中与声速一致gydF4y2Ba^44gydF4y2Ba)．这种结构各向异性已经完全衰减ΔgydF4y2BatgydF4y2Ba= 100 ps。gydF4y2Ba

在∆处观察到视网膜多烯链的光诱导结构变化gydF4y2BatgydF4y2Ba= 1 ps作为一个强的负电子密度差特征(最小值为- 6.2)gydF4y2BaσgydF4y2Ba,在那里gydF4y2BaσgydF4y2Ba是单位细胞的均方根电子密度)和互补的正差电子密度特征(最大值为+5.8gydF4y2BaσgydF4y2Ba)(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba答案CgydF4y2Ba_11gydF4y2Ba= CgydF4y2Ba_12gydF4y2Ba双键表明这个键已经异构化。这一现象与碳原子附近电子密度的变化有关gydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba甲基(−6.6gydF4y2BaσgydF4y2Ba和+ 5.6gydF4y2BaσgydF4y2Ba)．对这些电子密度变化进行建模，结合晶体学观察的结构细化，推断出光激活中间体的100%占用(光激活水平，请参阅gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba及扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba；1-， 10-和100-ps的时间延迟)建立视网膜异构化涉及一个大的(47.7°)顺时针旋转(从PSB上看)CgydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba甲基(如果采用传统的二面角符号，从β-ionone侧看，则为逆时针)。这种旋转发生在细胞外侧，与近端水分子W01和Tyr268的转移一致gydF4y2Ba^{6.51gydF4y2Ba}Glu181笼(图;gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．C的倾斜gydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba甲基增加(扩展数据图。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)变化为51.3°gydF4y2BatgydF4y2Ba= 100 ps。在缺乏时间分辨率的低温捕获bath - rh状态研究中，测量到类似的扭曲为54.9°gydF4y2Ba^10gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba6 fgydF4y2Ba)．我们得出结论，在使用的照明条件下，产生了一个稳定的结构状态。虽然很难获得排除多光子吸收对所观察到的结构状态影响的直接证据，但这表明所观察到的结构变化在定性上是正确的。视网膜的平面包含CgydF4y2Ba_19gydF4y2Ba甲基，它位于异构化碳的对面gydF4y2Ba_11gydF4y2Ba= CgydF4y2Ba_12gydF4y2Ba键，由Thr118固定在静息态gydF4y2Ba^{3.33gydF4y2Ba}(3.36 Å away)gydF4y2Ba^{45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba}和Try191gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}．因此，CgydF4y2Ba_19gydF4y2Ba甲基只受到最小程度的影响gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba- - - - - - - - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba异构化(无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，只向191号火山移动了半埃gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}(有36.0°旋转补偿由向后肘部运动的多烯链)和在相反的方向CgydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba甲基(图。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这些重排在Δ的视网膜分子中gydF4y2BatgydF4y2Ba= 1 ps与光异构化失败的“自行车踏板”机制兼容gydF4y2Ba^{14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba}其中CgydF4y2Ba_19gydF4y2Ba视网膜的甲基在紧密的结合袋中具有特定的残基，可以抵抗这种甲基的更大旋转。故选CgydF4y2Ba_9gydF4y2Ba= CgydF4y2Ba_10gydF4y2Ba异构化是多烯链上的能量释放，主要影响CgydF4y2Ba_8gydF4y2Ba和CgydF4y2Ba_10gydF4y2Ba，它们相对于C的方向相反gydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba甲基(图。gydF4y2Ba2 b, cgydF4y2Ba)．CgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba- cgydF4y2Ba_11gydF4y2Ba视黄醛多烯链的一段是弯曲的，使所有的碳以近乎完美的弧度排列。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)，从而影响捆绑袋内周围的相互作用。gydF4y2Ba

通过在Δ上对实验结构进行量子力学/分子力学(QM/MM)优化计算该态的吸收最大值gydF4y2BatgydF4y2Ba= 1 ps，以及随后在地面与PSB的光学主动第一激发态之间的垂直激发能计算(gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba)．这产生了相对于暗态32 nm的光谱红移(对于由视网膜PSB, Glu113组成的扩展QM系统而言)gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba}, Glu181gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}, Tyr191gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}, Tyr268gydF4y2Ba^{6.51gydF4y2Ba}, Ser186gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}和水W01)，与31 nm的实验红移(参考文献)一致。gydF4y2Ba^51gydF4y2Ba)用于bath - rh(扩展数据表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．值得注意的是，在一个简单的QM系统(视网膜PSB)上，使用CASPT2//CASSCF/AMBER方法对牛视紫红质的第一个QM/MM计算产生了约22 nm的红移(参考文献)。gydF4y2Ba^48gydF4y2Ba)，这与我们在等效QM体系中计算的24 nm值相当。我们对扩展QM系统的计算也表明，扭曲的全-gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba视网膜在1ps时储存超过36千卡每摩尔gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}与平面11-的能量比较gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba构象(作为比较，480纳米光子的能量为59.6千卡摩尔gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，与实验值32 kcal mol吻合较好gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}测量视紫红质到bath - rh的转变gydF4y2Ba^52gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

光诱导异构化将视网膜转化为一种激动剂，与视紫红质结合位点的残基发生不同的相互作用。光活化后一皮秒，异构化全部gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba视网膜的容量与11-相同gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba静止构象，证实了节省空间运动的假设gydF4y2Ba^47gydF4y2Ba，但现在没有几个氢键和范德华相互作用，使暗态结构稳定在一个不活跃的构象(图。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba)．共价结合的视网膜弯曲像一个弧，在中间稳定的空间位阻和范德华相互作用之间的CgydF4y2Ba_19gydF4y2Ba和CgydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba视网膜的甲基和两个来自祖先反离子网络的酪氨酸残基，Tyr191gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}和Tyr268gydF4y2Ba^{6.51gydF4y2Ba}．C的异构化和旋转gydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba-methyl-CgydF4y2Ba_13gydF4y2Ba- cgydF4y2Ba_14gydF4y2Ba平面诱导弯曲CgydF4y2Ba_15gydF4y2Ba多烯链对相邻的PSB/Glu113的影响很小gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba}在Glu113氢键网络中，除了周围水的顺序W04外(图4)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba6克,hgydF4y2Ba)．多烯链与Ala117的相互作用gydF4y2Ba^{3.32gydF4y2Ba}-Thr118gydF4y2Ba^{3.33gydF4y2Ba}是否有两个与TM3的关键视网膜接触在Δ被削弱gydF4y2BatgydF4y2Ba= 1 ps(对比图;gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba无花果。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba；扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(上)和补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．另一个与TM3的相互作用被中断，在异构键和Cys187之间gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}结构上重要且高度保守的二硫化物桥Cys187-Cys110(参考文献。gydF4y2Ba^53gydF4y2Ba)，将TM3连接到ECL2(对比图。gydF4y2Ba3 a, bgydF4y2Ba无花果。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)．值得注意的是，在牛视紫红质视网膜周围观察到的光诱导结构变化与从细菌和古生菌中观察到的其他低同源性7 - tm螺旋视网膜结合蛋白在拓扑上有一些相似之处。例如，视网膜和TM3(在原核视蛋白中对应于螺旋C)之间的一些相互作用的减弱或中断也被观察到(扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(下))中的细菌视紫红质gydF4y2Ba^24gydF4y2Ba，钠光敏泵KR2gydF4y2Ba^{24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}氯离子泵gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba人力资源gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba它们都经历着完全不同的激活机制。因此，尽管它们不同的进化起源和异构化类型(11-gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba所有- - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba和所有- - -gydF4y2Ba反式gydF4y2Ba13 -gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba)，视网膜结合蛋白似乎也需要在进行下一步的激活之前将视网膜从TM中心螺旋中分离出来。gydF4y2Ba

随着哺乳动物视紫红质沿着其反应途径进化，一些观察到的变化将变得更加明显，而另一些将恢复原状(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba及扩展数据表gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)．由ΔgydF4y2BatgydF4y2Ba= 10和100 ps， β-ionone环和CgydF4y2Ba_19gydF4y2Ba- cgydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba甲基仍然分别与Gly121相互作用gydF4y2Ba^{3.36gydF4y2Ba}-Glu122gydF4y2Ba^{3.37gydF4y2Ba}Glu181的酪氨酸gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}极笼(图;gydF4y2Ba3 e, fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba(上))，而例如Tyr268gydF4y2Ba^{6.51gydF4y2Ba}和Pro267gydF4y2Ba^{6.50gydF4y2Ba}TM6松弛到初始位置值得注意的是，通过TM6观察到的能量耗散的各向异性特征与暗态视紫红质分子动力学模拟中的固有结构波动是兼容的(扩展数据图)。gydF4y2Ba5 c, dgydF4y2Ba)．这种螺旋结构对细胞内G蛋白结合位点相对刚性，但对细胞外结构域明显更灵活，具有关键的Pro267gydF4y2Ba^{6.50gydF4y2Ba}在关节处。gydF4y2Ba

尽管视紫红质被认为是典型的a类GPCR，但GPCRs通过构象选择识别扩散激动剂配体的机制与光激活的GPCRs(如视紫红质)所显示的诱导匹配的极端情况有很大不同gydF4y2Ba^54gydF4y2Ba．值得注意的是，构象选择和诱导拟合迅速收敛为一个共同的gpcr激活机制gydF4y2Ba^55gydF4y2Ba因此，视网膜异构化的早期阶段可能揭示GPCRs激动的基本决定因素。例如，视网膜结合袋的早期结构变化与Pro215附近的小向外倾斜(约0.5 Å)有关gydF4y2Ba^{5.50gydF4y2Ba}和Pro267gydF4y2Ba^{6.50gydF4y2Ba}，位于TM5和TM6中间附近(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)，并使受体细胞外部分的各向异性运动(扩展数据图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这两种脯氨酸残基在A类GPCRs中都是保守的，并且是激动剂诱导激活的关键gydF4y2Ba^56gydF4y2Ba．此外，TM3是一个在a类GPCRs TM包的体系结构中具有核心作用的区域gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba通过形成配体和G蛋白结合袋的一部分。我们的TR-SFX数据显示，即使在激活的早期阶段，逆激动剂(11-gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba视网膜)从TM3剥离(图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4gydF4y2Ba及补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)同时异构化为激动剂构象(图。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba)．TM3中几个受影响的位置(Glu113gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba}, Thr118gydF4y2Ba^{3.33gydF4y2Ba}, Gly121gydF4y2Ba^{3.36gydF4y2Ba}和Glu122gydF4y2Ba^{3.37gydF4y2Ba})对应于A类GPCRs结合位点上参与配体结合的保守残基gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba，与Gly121结合gydF4y2Ba^{3.36gydF4y2Ba}特别是作为配体识别的共识“摇篮”支架的一部分gydF4y2Ba^57gydF4y2Ba．因此，我们使用XFEL的TR-SFX观察揭示了视网膜的光激活构象如何迅速削弱与视紫红质结合袋的氨基酸的许多范德华斯相互作用(图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)，从而将受体的弛豫通路引向其G蛋白结合信号构象。gydF4y2Ba

我们在室温下的非活性暗态视紫红质的高分辨率SFX结构揭示了蛋白质中水介导的氢键网络的完整结构。光激活一皮秒后，视紫红质已达到红移bath - rh中间体。在激活的早期阶段，扭曲的视网膜已经从与结合袋的许多相互作用中解放出来，而结构扰动以瞬态各向异性呼吸运动的形式辐射出去，几乎完全衰减了100 ps。蛋白质中其他微妙和短暂的结构重排出现在GPCR激活的重要区域，与TR-SFX在细菌和古生菌的7 - tm螺旋视网膜结合蛋白光激活过程中观察到的结构重排相似。因此，我们认为蛋白质通过早期的GPCR结构途径分散了最初多余的能量，这将被用于激活。我们的研究揭示了视紫红质通过GPCR激活途径的保守残基发生的超快能量耗散，为研究A类GPCRs大家族的早期激活事件奠定了实验基础。gydF4y2Ba

视网膜中视紫红质的提取和纯化gydF4y2Ba

所有提取纯化步骤均在昏暗的红光条件下进行。市售的深色适应冷冻牛视网膜(W L Lawson公司)根据前面描述的方案被用于分离棒外段(ROS)膜gydF4y2Ba^59gydF4y2Ba．简而言之，200个冷冻牛视网膜在ROS缓冲液(10 mM MOPS, 30 mM NaCl, 60 mM KCl, 2 mM MgCl)中稀释gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1 mM DTT)， 40% (w/w)蔗糖和2片cOmplete蛋白酶抑制剂鸡尾酒。用手摇晃混合物4分钟，在4°C, 4000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟。重复这一步骤，将聚集的上清液混合，用不含蔗糖的ROS缓冲液稀释一半，在4°C, 24000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟。将微球重新悬浮在含23.4%蔗糖的ROS缓冲液中，并将其叠放在新制备的梯度上，其中两层ROS缓冲液分别含有34% (w/w)和29% (w/w)蔗糖。使用SW28旋转转子在4°C, 110,000的条件下对ros膜负载的梯度进行离心gydF4y2BaggydF4y2Ba将含视紫红质层(23-29%界面层和29%层)抽吸90分钟，在液氮中快速冷冻。暗态ROS膜的视紫红质浓度，通过记录光照前后的紫外/可见光谱来确定，通常产生200±40 mg视紫红质。如前所述，牛视紫红质可以通过洗涤剂增溶和亲和层析，使用豆蛋白a树脂(ConA, GE医疗生命科学公司)进一步分离gydF4y2Ba^60gydF4y2Ba．优化方案:(1)起始视网膜材料加倍;(2)树脂用量按比例放大3倍;(3)为使洗脱剖面更加清晰，洗脱后半段采用逆流进行。将含有180±20mg视紫红质的ROS膜悬浮液在ConA缓冲液(50 mM醋酸钠，150 mM NaCl, 3 mM MgCl)中稀释三次gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba6小时gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 3mm MnClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 3mm CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 1mm NagydF4y2Ba_2gydF4y2Baedta 2 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 2 mm2 -巯基乙醇，pH 6)，在4°C, 104,000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba35分钟。将得到的ROS膜颗粒重悬在含有一片蛋白酶抑制剂的90 ml ConA缓冲液中，并在室温下用十二烷基二甲胺氧化物(LDAO, Sigma-Aldrich)溶解膜至最终浓度为1%。溶解样品在4°C, 118,000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在含有0.1% (w/v) LDAO的ConA缓冲液中进行ConA亲和层析60 min, 0.2 M甲基α-直接洗脱gydF4y2BadgydF4y2Ba-甘露吡喃苷在同一缓冲液中。视紫红质等分2毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在液氮中快速冷冻，并准备用于LCP结晶。gydF4y2Ba

结晶和TR-SFX样品制备gydF4y2Ba

所有结晶和样品制备步骤都在昏暗的红光条件下进行。在LCP结晶前，将快速冷冻的纯化的视紫红质等分液解冻，并交换0.21%的洗涤剂gydF4y2BangydF4y2Ba癸-gydF4y2BaNgydF4y2Ba,gydF4y2BaNgydF4y2Ba二甲胺-gydF4y2BaNgydF4y2Ba-氧化物(DAO, Anatrace)在50 mM醋酸钠，150 mM NaCl, 3 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， pH 6.0，使用PD10缓冲液交换柱(Sigma-Aldrich)。洗脱液在18°C, 21000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟，进一步浓缩至至少20-25毫克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}使用浓缩器Ultra 4 MWCO 30在18°C和4000gydF4y2BaggydF4y2Ba．离心18°C, 21000gydF4y2BaggydF4y2Ba蛋白质样品在22°C下与单油酸(1-油酸-rac-甘油，Nu-Check prep)分别以40比60的比例混合15分钟，使用气密Hamilton注射器，直到形成半透明LCP。衍射良好的视紫红质晶体最初是由低分子质量的聚乙二醇屏与各种类型的缓冲，第一次击中检测使用二次谐波成像SONICC(二阶非线性光学成像手性晶体)装置(Formulatrix)。gydF4y2Ba^61gydF4y2Ba．为了晶体生长，将20-40 μ l蛋白负载LCP注入含有200-400 μ l沉淀剂(37-39% PEG 600和100 mM Bicine pH 9.0)的Hamilton玻璃注射器中。或者，将80 μ l蛋白负载LCP注射到含有800 μ l沉淀剂的1 ml塑料注射器中。样品用铝包裹，保存于18°C。3天后，通过去除沉淀剂，LCP中尺寸约为15 × 15 × 1.5 μ m的板状晶体可以收集到，并在18°C的黑暗中保持稳定数周。gydF4y2Ba

在x射线自由电子激光光束线上，含有视紫红质晶体的LCP样品必须与三通耦合器混合以确保均匀性gydF4y2Ba^62gydF4y2Ba在装入高粘度喷油器之前。为了防止残留沉淀剂污染，负载lcp的晶体样品用PEG 1000 (50% (w/v))滴定，最后与单烯烃1:5混合。gydF4y2Ba

时间分辨泵浦探针系列结晶学gydF4y2Ba

在SACLA的XFELs BL3_EH2端站采集x射线衍射数据gydF4y2Ba^63gydF4y2Ba(波束时间2015B8043和2018A8066)和瑞士fel的Alvra端站(波束时间20172060和20200597)。x射线束的能量为9-10 keV，脉冲长度为10 fs (SACLA)和65 fs (SwissFEL)，聚焦在1 × 1µm (SACLA)和5 × 5µm (SwissFEL)样品上。在昏暗的红光条件下，在样品位置将飞秒泵浦激光设置为480 nm波长，脉冲能量为9 (SACLA)到5 (SwissFEL) μ J / 100 fs脉冲持续时间。泵浦激光束尺寸为47 ~ 50 μ m FWHM (80 ~ 85 μ m 1/e)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)．如果假设理想的高斯光束光学，那么这对应的峰值能量密度为200兆焦耳厘米gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}在瑞士fel (Δ)gydF4y2BatgydF4y2Ba= 1 ps)，或者平均能量密度为140兆焦耳厘米gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}平均激光的焦点FWHM(与参考文献中的表格数据比较。gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}；峰值功率密度为2000千兆瓦厘米gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba})．SACLA研究的相应值(ΔgydF4y2BatgydF4y2Ba= 100 ps)的峰值通量为360 mJ cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}，平均通量260 mJ cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}，峰值功率密度为3,600 GW cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}．实验照明条件的选择，以产生高占用这些观察到的结构状态，随着时间的推移演变。虽然这些条件在光谱实验中被认为是过分的，但如果计算平均通量的乘积(gydF4y2BaFgydF4y2Ba)，静息态吸收截面(gydF4y2BaσgydF4y2Ba)除以单个光子的能量(gydF4y2BahgydF4y2BaνgydF4y2Ba,在那里gydF4y2BahgydF4y2Ba普朗克常数和gydF4y2BaνgydF4y2Ba光子的频率)我们恢复gydF4y2BaσgydF4y2BaFgydF4y2Ba/gydF4y2BahgydF4y2BaνgydF4y2Ba= 45的照明条件在瑞士fel和gydF4y2BaσFgydF4y2Ba/gydF4y2BahνgydF4y2Ba在SACLA使用的= 81。尽管这些值可能表明相当大的多光子激发，但时间分辨的x射线溶液散射对视紫红质的研究结果(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)意味着更少的被吸收的光子会导致样品中的加热(参见下面的“时间分辨x射线溶液散射”部分)。此外，使用泵浦激光器的60%的能量(3 μ J每100-fs脉冲，764 GW cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba})表示在我们的TR-SFX研究中适用的最低能量(扩展数据图。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)和高于每个视紫红质单光子的光激活状态，这为非线性效应对所观察到的光化学作用的贡献提供了可能性。gydF4y2Ba

在LCP中生长的牛视紫红质晶体用于收集TR-SFX数据，时延分别为1 ps、10 ps (SwissFEL)和100 ps (SACLA)(扩展数据图)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．采用75 μm喷嘴，在流速为0.033 μl min的恒定条件下，用高粘度喷射器对晶体进行挤压gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(瑞士fel)或2.5 μl mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(SACLA)gydF4y2Ba^64gydF4y2Ba到泵浦探测交点收集数据，每五次泵浦激光被阻塞(数据收集方案为4个光激活，然后1个暗)(SwissFEL)或交错ON/ off激光(在模式1光:1暗(SACLA))，取决于XFELs的重复频率(SwissFEL 25 Hz;SACLA 30 Hz)和泵浦激光器(SwissFEL 25 Hz;SACLA 15 Hz)。作为对照，在泵浦激光器关闭的情况下也收集了真实的暗态数据(所有暗态数据，SFX模式)。gydF4y2Ba

TR-XSS分析gydF4y2Ba

TR-XSS研究使用使用气体动力学虚拟喷嘴(GDVN)液体微射流注入的洗涤剂溶解的视紫红质样品，如前所述，在LCLS进行gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．视紫红质溶于gydF4y2BangydF4y2Ba-十二烷基-β-麦芽糖苷浓度为8.4 mg mlgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(0.2毫米)。使用480 nm激光脉冲光激活样品，激光脉冲持续50秒，通过1/e聚焦gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba直径为100 μm (59 μm FWHM)，脉冲功率为6 μJ (110 mJ cm)gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}FWHM均值;3000千兆瓦厘米gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}峰值功率)，22 μJ (400 mJ cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}FWHM均值;11200千兆瓦厘米gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}峰值功率)，45 μJ (830 mJ cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}FWHM均值;22,900 GW cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}峰值功率为89 μJ (1640 mJ cm)gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}FWHM均值;45300千兆瓦厘米gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}峰值功率)。从这些数据估计激光诱导加热的时间延迟为10ps≤ΔgydF4y2BatgydF4y2Ba≤1 μs(扩展数据图;gydF4y2Ba3 fgydF4y2Ba)，但这些数据的稀疏采样和信噪比不允许在该时域内提取多个加热基谱。相比之下，对洗涤剂溶解光合反应中心的TR-XSS研究允许在光激发后的前100 ps内提取两个基本光谱。在该研究中，与第一热基谱相关的振幅在Δ处达到最大值gydF4y2BatgydF4y2Ba= 10 ps，然后过渡到更长的时间尺度的加热基谱，这两个分量的振幅在Δ附近交叉gydF4y2BatgydF4y2Ba= 40 ps(参考。gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba)．我们的视紫红质TR-XSS数据中的主奇异值分解(SVD)成分与温度校准曲线进行了比较(扩展数据图)。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba)来估计不同光激发通量下激光引起的温度变化，如前所述gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．因此传递给样品的加热脉冲总结在扩展数据图中。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba，并使用负时间点作为对照(绘制为激光通量为零)。尽管这些TR-XSS数据表明，激光诱导的洗涤剂溶解样品的视紫红质加热随泵浦激光脉冲通量线性变化，但这并不意味着光激发发生在每个发色团的单光子线性响应极限内。此外，在这个时间尺度上存储在蛋白质内的任何能量(例如，视网膜内的应变)在TR-XSS数据中不会作为加热可见，因此任何可测量的高于光子当量的一部分的加热意味着多余的能量通过多光子吸收途径进入系统。gydF4y2Ba

使用扩展数据图。gydF4y2Ba3 hgydF4y2Ba作为激光加热诱导的校准曲线，我们可以估计使用GDVN液体微射流注入的洗涤剂溶解的视紫红质样品中引起的温度跳变(通量为140 mJ cm)gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}FWHM的平均值)将是ΔgydF4y2BaTgydF4y2Ba= 0.016±0.009°c;当暴露于SACLA使用的光激发(260兆焦耳厘米的影响gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}FWHM的平均值)将是ΔgydF4y2BaTgydF4y2Ba= 0.028±0.016°c。使用每个分子吸收光子的公式= ΔgydF4y2BaTgydF4y2Ba×gydF4y2BaCgydF4y2Ba_PgydF4y2Ba/((视紫红质)×gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba×gydF4y2BahνgydF4y2Ba),gydF4y2BaCgydF4y2Ba_PgydF4y2Ba= 3.8 J cmgydF4y2Ba^{−3gydF4y2Ba}作为膜蛋白在洗涤剂含量高的溶液中的近似热容(参考文献表2)。gydF4y2Ba^19gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba为阿伏伽德罗常数，gydF4y2BahgydF4y2Ba为普朗克常数，gydF4y2BaνgydF4y2Ba=gydF4y2BacgydF4y2Ba/gydF4y2BaλgydF4y2Ba为泵浦激光光子的频率，gydF4y2BacgydF4y2Ba光速和gydF4y2BaλgydF4y2Ba是泵浦激光波长。这些加热变化对应于在瑞士fel的光激发条件下，视紫红质发色团吸收了额外的1.2±0.7个光子，在SACLA的光激发条件下，吸收了额外的2.1±1.2个光子。然而，在将这些估计值外推到我们的TR-SFX研究之前，必须承认有相当大的不确定性。最重要的三个考虑因素是，适当的TR-XSS对照研究应使用与TR-XSS和TR-SFX研究相似的样品制剂进行，并使用相同的微喷射注射器(即在LCP中制备并使用粘性注射器注射的视紫红质);上述估计假设x射线束和激光焦点之间实现了良好的空间重叠，并且在LCLS的TR-XSS数据收集期间，这没有实质性的漂移;理想情况下，在TR-XSS和TR-SFX实验中，应使用相同的fs激光器进行光激发，并使用相同的工具测量激光聚焦光斑直径。尽管这些缺点增加了不确定性，但上述估计数明显低于按gydF4y2BaσFgydF4y2Ba/gydF4y2BahνgydF4y2Ba= 45的光激发条件用于瑞士fel和gydF4y2BaσFgydF4y2Ba/gydF4y2BahνgydF4y2Ba= 81的光激发条件在SACLA使用(gydF4y2BaσgydF4y2Ba_{480海里gydF4y2Ba}= 34,000米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}厘米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})．关于TR-SFX研究的适当光激发条件是什么，一直存在相当大的争论gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba}．我们的TR-XSS观察表明，与其他关于其他光敏蛋白的TR-XSS研究一样gydF4y2Ba^{3 gydF4y2Ba}，激光诱导样品加热不能被产品准确预测gydF4y2BaσFgydF4y2Ba/gydF4y2BahνgydF4y2Ba．这可能是由于在480 nm处第一激发态的横截面比基态的横截面要小得多;可能是由于光激发态具有相对较高的受激拉曼散射和受激发射截面，因此吸收的多余能量被发射的光子带走，而不是作为样品加热可见;微射流的散射会造成一定的能量损失;可能还有其他我们还不了解的因素。在上述TR-XSS研究中，视紫红质在晶体中浓度为4 mM，但在0.2 mM进行调整后，这些加热估计意味着，晶体内的温度跳跃不太可能像细菌视紫红质的TR-SFX研究中所声称的那样达到100°C的量级gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba同样不太可能的是，我们的TR-SFX数据是由激光诱导加热引起的准各向同性结构膨胀所主导的，在TR-XSS研究中，在一个光合反应中心观察到大约800个光子被每个发色团吸收gydF4y2Ba^65gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

数据处理gydF4y2Ba

所有数据都使用INDEXAMAJIG和XGANDALF算法对SwissFEL (SF dark, 1 ps, 10 ps)和MOSFLM收集的数据进行索引gydF4y2Ba^66gydF4y2Ba, DirAxgydF4y2Ba^67gydF4y2Ba和XGANDALFgydF4y2Ba^68gydF4y2Ba在SACLA收集数据的算法(SACLA暗，100 ps)。SwissFEL数据的积分半径设置为2像素，SACLA数据的积分半径设置为3像素，而SwissFEL数据的背景环空设置为4至6像素，SACLA收集的数据的背景环空设置为4至7像素。晶体到探测器的距离在每次运行的基础上进行了优化，首先以200µm采样探测器距离在91.5 mm到97.5 mm (SwissFEL)之间，然后以47.5 mm到53.5 mm (SACLA)之间，然后以20µm增量来确定探测器距离，在此距离下，单位细胞尺寸的标准偏差最小化。gydF4y2Ba

在PARTIALATOR中分别对SwissFEL和SACLA数据进行缩放和合并gydF4y2Ba^69gydF4y2Ba，使用XSPHERE偏心建模gydF4y2Ba^70gydF4y2Ba．自定义分裂用于输出单独的暗和光激活反射文件，为每个自由电子激光器收集的数据。gydF4y2Ba

在晶体中发现了晶格易位缺陷gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba在用phenix.xtriage检查帕特森地图后gydF4y2Ba^71gydF4y2Ba．特别地，在td =(0.000, 0.245, 0.000)处的Patterson峰('平移向量(gydF4y2Ba道明gydF4y2Ba)的扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 d - igydF4y2Ba)被归因于晶体中存在两个翻译相关的结构域。修正gydF4y2Ba^36gydF4y2Ba检索单域强度所需的强度已在前面描述过gydF4y2Ba^72gydF4y2Ba，翻译域内分子的百分比(gydF4y2BaκgydF4y2Ba)('翻译分数(gydF4y2BakgydF4y2Ba)的扩展数据表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 d - igydF4y2Ba)是通过修正增加时的强度来确定的gydF4y2BaκgydF4y2Ba值以1%的增量从0%到50%，直到(0.000,0.245,0.000)帕特森峰值被压平。该修正导致SACLA暗态Rfree从26.11%降低到23.92%，并提高了暗态电子密度图的可解释性，从而进一步改进了模型(扩展数据图。gydF4y2Ba1 d - igydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

视紫红质暗态的结构测定与精制gydF4y2Ba

PDBgydF4y2Ba1日19gydF4y2Ba(ref。gydF4y2Ba^73gydF4y2Ba)，去除溶剂和配体分子，作为Phaser MR中的分子替换搜索模型gydF4y2Ba^74gydF4y2Ba．利用Phenix.refine软件进行多次迭代优化和迭代建模后，得到了暗态结构gydF4y2Ba^75gydF4y2Ba和傻瓜gydF4y2Ba^76gydF4y2Ba．使用JLigand生成了一个额外的配体几何文件，以抑制连接赖氨酸侧链和视网膜的PSB的几何结构gydF4y2Ba^77gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

计算密度差图gydF4y2Ba

FgydF4y2Ba_ogydF4y2Ba(光),gydF4y2BaFgydF4y2Ba_ogydF4y2Ba(暗)振幅由晶格平移缺陷校正强度计算gydF4y2Baphenix.french_wilsongydF4y2Ba^71gydF4y2Ba而且gydF4y2BaFgydF4y2Ba_ogydF4y2Ba(光)−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_ogydF4y2Ba(暗)差图使用phenix.fobs_minus_fobs_map计算gydF4y2Ba^71gydF4y2Ba使用多重缩放选项排除小于3的振幅gydF4y2BaσgydF4y2Ba并且在9 Å和1.8 Å之间的分辨率范围内使用反射。所有gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}(光)−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}(暗)的计算使用的阶段的细化暗状态。gydF4y2Ba

计算gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}差分图，gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}使用SFall计算振幅，使用Scaleit对实验数据进行缩放，使用FFT计算差分图，分辨率为1.7 Å，所有程序都可在CCP4套件中获得gydF4y2Ba^78gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了整合和绘制通量响应曲线的密度，在瑞士fel记录的两个10 ps光数据集和1 ps光数据集被缩减到最小数据集的大小(约29,000个模式)。这些数据被比比例和合并描述为地图计算，和差图计算完全相同的方式。基于ref的自定义MATLAB脚本。gydF4y2Ba^79gydF4y2Ba用于以CgydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba和CgydF4y2Ba_12gydF4y2Ba激发态的原子。然后用密度与通量作对比。gydF4y2Ba

数据外推gydF4y2Ba

外推数据的计算使用晶格平移校正数据，并根据前面描述的方法gydF4y2Ba^80gydF4y2Ba．线性近似方法如下:gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{额外的gydF4y2Ba}= 100 /gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba×(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_obgydF4y2Ba(光)−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}) +(黑暗)gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba},在那里gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba激活水平以百分比表示，gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{额外的gydF4y2Ba}表示外推的结构因子振幅和gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}表示暗态模型的计算振幅。每个时间点的激活级别是使用前面描述的方法独立确定的gydF4y2Ba^80gydF4y2Ba．简而言之，计算外推数据时，激活水平范围为10%至50%，增量为1%gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{额外的gydF4y2Ba}−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}计算了来自暗态模型的差分图和相位。- 2gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{额外的gydF4y2Ba}−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}C附近密度gydF4y2Ba_11gydF4y2BaCgydF4y2Ba_12gydF4y2Ba和CgydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba视网膜，在视网膜上显示负密度特征gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}(光)−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{奥林匹克广播服务公司gydF4y2Ba}(暗)地图，被整合的半径为1.5 Å以上在1.5gydF4y2BaσgydF4y2Ba每个激活级别的截止日期。- 2gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{额外的gydF4y2Ba}−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}差异密度绘制为激活水平的函数;当高估激活水平时，很少有2gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{额外的gydF4y2Ba}−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}这些原子位置的密度差为负，而大小为负2gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{额外的gydF4y2Ba}−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}当激活水平被低估时，差异密度增大。然后，通过计算图的两个线性部分之间的交集来确定激活水平，以找到负密度开始出现的激活水平。由于在不同的实验条件下收集了三个光激活数据集，因此分别独立计算(SwissFEL 1 ps 21%， SwissFEL 10 ps 20%， SACLA 100 ps 22%)。gydF4y2Ba

光激活态的细化gydF4y2Ba

利用Phenix.refine中1-ps和10-ps时间点的外推数据，使用SwissFEL的暗态模型作为初始模型进行细化gydF4y2Ba^75gydF4y2Ba，与Coot互动模型构建gydF4y2Ba^76gydF4y2Ba是为了将模型与2gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{额外的gydF4y2Ba}−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_{calcgydF4y2Ba}映射和去除缺乏电子密度的水分子。以SACLA暗态模型为起点，从SACLA 100-ps数据开始执行相同的迭代过程。gydF4y2Ba

残留编号gydF4y2Ba

除了根据它们在主序列中的位置给出一个数字外，视紫红质中的残基还根据Ballesteros-Weinstein方案被分配一个“一般”数字gydF4y2Ba^81gydF4y2Ba．ballestero - weinstein一般数由两个用圆点分隔的数组成，其中第一个表示螺旋(1到8)，第二个表示相对于该螺旋中最保守的残余的位置，任意分配为50。例如，Glu113gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba}表示反离子Glu113位于TM3中，在TM3中最保守的残基(Arg135)之前有22个残基gydF4y2Ba^{3.50gydF4y2Ba})．gydF4y2Ba

本研究中大多数氨基酸的Ballesteros编号为Met44gydF4y2Ba^{1.39gydF4y2Ba}, Met86gydF4y2Ba^{2.53gydF4y2Ba}, Phe91gydF4y2Ba^{2.58gydF4y2Ba}, Thr94gydF4y2Ba^{2.61gydF4y2Ba}, Glu113gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba}, Ala117gydF4y2Ba^{3.32gydF4y2Ba}, Thr118gydF4y2Ba^{3.33gydF4y2Ba}, Cys110gydF4y2Ba^{3.25gydF4y2Ba}, Gly120gydF4y2Ba^{3.35gydF4y2Ba}, Gly121gydF4y2Ba^{3.36gydF4y2Ba}, Glu122gydF4y2Ba^{3.37gydF4y2Ba}, Met207gydF4y2Ba^{5.42gydF4y2Ba}, His211gydF4y2Ba^{5.46gydF4y2Ba}, Phe212gydF4y2Ba^{5.47gydF4y2Ba}, Pro215gydF4y2Ba^{5.50gydF4y2Ba}, Phe261gydF4y2Ba^{6.44gydF4y2Ba}, Trp265gydF4y2Ba^{6.48gydF4y2Ba}, Pro267gydF4y2Ba^{6.50gydF4y2Ba}, Tyr268gydF4y2Ba^{6.51gydF4y2Ba}, Ala269gydF4y2Ba^{6.52gydF4y2Ba}, Ala292gydF4y2Ba^{7.39gydF4y2Ba}, Phe293gydF4y2Ba^{7.40gydF4y2Ba}和Lys296gydF4y2Ba^{7.43gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

水命名法gydF4y2Ba

W01(链C/HOH #01)在C端gydF4y2Ba_20.gydF4y2Ba/受潮湿腐烂;W02 (C/HOH #02链)Ser186;对离子Glu113 (Gly90, Phe91, Ala117)近端W03(链C/HOH #103);W04(链C/HOH #119)在Met86 (Phe91, Phe116, Ala117)，低使用率增加ΔgydF4y2BatgydF4y2Ba= 1 ps，由Δ重置gydF4y2BatgydF4y2Ba= 100 ps。gydF4y2Ba

QM / MM计算gydF4y2Ba

本工作中报道的TR‐SFX晶体结构被用作计算的初始几何结构。利用PROPKA程序获得蛋白中可滴定氨基酸残基在pH 9.0时的pKa值gydF4y2Ba^{82gydF4y2Ba,gydF4y2Ba83gydF4y2Ba}．随后，根据之前计算的pKa值，使用AMBER软件包中的程序tleap对蛋白质进行质子化gydF4y2Ba^84gydF4y2Ba在对视网膜和Lys296施加位置限制的同时，我们首先进行了短的(50步)分子力学(MM)能量最小化gydF4y2Ba^{7.43gydF4y2Ba}缓解空间冲突。随后，利用混合QM/MM优化了视紫红质暗态和光态(1 ps和100 ps)的几何形状gydF4y2Ba^85gydF4y2Ba在气相。在模拟过程中，蛋白质的骨架被冷冻。在最简单的系统中，QM部分仅由视网膜发色团和形成质子化希夫碱(RPSB)的Lys296侧链组成。氢键原子(HLA)方案gydF4y2Ba^86gydF4y2Ba用于将QM/MM边界置于CgydF4y2Ba_δgydF4y2Ba和CgydF4y2Ba_εgydF4y2BaLys296侧链上的原子。我们还考虑了一个更扩展的QM区域，包括近端反离子(Glu113gydF4y2Ba^{3.28gydF4y2Ba})，祖传反离子(Glu181 .gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}), Ser186gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}, Tyr191gydF4y2Ba^{ECL2gydF4y2Ba}, Tyr268gydF4y2Ba^{6.51gydF4y2Ba}和水W01。QM部分使用BP86‐D3(BJ)函数进行描述gydF4y2Ba^{87gydF4y2Ba,gydF4y2Ba88gydF4y2Ba}与cc‐pVDZ基集结合使用gydF4y2Ba^89gydF4y2Ba以及用于识别身份的def2/J辅助基集gydF4y2Ba^90gydF4y2Ba．球链交换(COSX)算法与库仑项(RI‐J)的单位分辨率结合使用。剩余的蛋白用Amber ff14SB力场处理gydF4y2Ba^91gydF4y2Ba．采用TIP3P模型描述水分子gydF4y2Ba^92gydF4y2Ba．QM/MM优化是使用量子化学程序Orca (v.5.0.2)进行的。gydF4y2Ba^93gydF4y2Ba与ChemShell (v.3.7.1)软件包的DL_POLY模块接口gydF4y2Ba^{94gydF4y2Ba,gydF4y2Ba95gydF4y2Ba}．最小基态几何和部分电荷被用于计算RI‐ADC(2)理论水平的垂直激发能gydF4y2Ba^96gydF4y2Ba冻结核心轨道和cc‐pVTZ基与相应的辅助基相结合gydF4y2Ba^89gydF4y2Ba．此外，为了考虑QM/MM几何优化对激发的影响，我们计算了最简单QM/MM系统暗态和底态部分MM最小化结构的垂直激发能量。RI‐ADC(2)的计算使用Turbomole (v.7.5.1)程序包进行gydF4y2Ba^97gydF4y2Ba．所有的计算都是使用保罗·谢勒研究所的超级计算设施进行的。gydF4y2Ba

分子动力学模拟gydF4y2Ba

我们使用来自GPCRmd数据库的分子动力学模拟数据gydF4y2Ba^98gydF4y2Ba，一个开放获取的研究资源，拥有迄今为止解决的大多数GPCR 3D结构的分子动力学模拟的综合数据集。GPCRmd提供了几种工具来交互式地分析模拟轨迹，或者，它们可以下载并在本地进行分析。具体来说，我们将视紫红质的三个模拟副本(3 × 2500帧)连接在一起(PDB:gydF4y2Ba1 gzmgydF4y2Ba；轨迹id 16414, 16415和16416)嵌入到与水和离子溶剂化的脂质双分子层中，并模拟1.5µs的聚合时间(即每个副本500ns)。我们使用了Python (v.3.10)和MDanalysis库gydF4y2Ba^{99gydF4y2Ba,gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba}获取模拟数据，计算蛋白质Cα原子的平均均方根波动。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

有关研究设计的进一步资料，请参阅gydF4y2Ba自然组合报告摘要gydF4y2Ba链接到这篇文章。gydF4y2Ba