摘要
生物分子之间的相互作用是所有细胞过程的基础，并最终控制细胞的命运。通过突变、表达水平的改变或外部刺激对原生相互作用的干扰导致细胞生理学的改变，并可能导致疾病或治疗效果1，2．绘制这些相互作用并确定它们对刺激的反应是许多药物开发工作的起源，从而导致新的治疗靶点和改善人类健康1．然而，在复杂的细胞核环境中，由于低丰度、短暂或多价结合以及缺乏能够在不破坏所研究的蛋白质结合表面的情况下研究这些相互作用的技术，确定蛋白质-蛋白质相互作用具有挑战性3.．在这里，我们描述了一种方法，无痕迹地将铱光敏剂纳入核微环境使用工程分裂的内芯。这些ir催化剂可以通过Dexter能量转移激活二氮嘧啶弹头，在大约10纳米半径内形成活性碳烯，与即时微环境中的蛋白质交联(称为µMap)，用于定量化学蛋白质组学分析4．我们表明，这种纳米尺度的接近标记方法可以揭示癌症相关突变存在时相互作用体的关键变化，以及小分子抑制剂的治疗。µMap提高了我们对核蛋白-蛋白相互作用的基本理解，在这样做的过程中，预计将对学术界和工业界的表观遗传药物发现领域产生重大影响。
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作者信息
作者及隶属关系
贡献
c.p.s.， a.j.b.， T.W.M.和D.W.C.M.构思了这个作品。c.p.s.、a.j.b.、x.s.、g.l.、r.e.k.、T.W.M.和D.W.C.M.设计并执行了实验。c.p.s.， a.j.b.， T.W.M.和D.W.C.M.准备了这份手稿。
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
D.W.C.M.和C.P.S.已根据本工作中使用的光催化剂申请了一项临时美国专利，62/982,366和63/076,658，国际申请号为。PCT / US2021/019959。D.W.C.M.声明所有权权益，C.P.S.声明在Dexterity Pharma LLC公司的附属权益，该公司已将本工作中使用的材料商业化。其余作者声明没有竞争利益。
同行评审
同行评审信息
自然感谢Stephen Frye, Michiel Vermeulen和其他匿名审稿人对这项工作的同行评审所做的贡献。
额外的信息
出版商的注意施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。
扩展的数据图形和表格
扩展数据图1 H3.1 vs CENP-A和H2A WT vs H2A E92K实验的支持数据
Anti-FLAG western blot检测H3.1-HA-Cfa的表达N-FLAG, H3.1 (4xAla)-HA-CfaN-FLAG (MS实验中未使用)和CENP-A-HA-CfaN国旗。以考马斯蓝染色可见的H4作为加载对照。H3.1-HA-Cfa-N-FLAG的MW = 29,365 Da。B) H3.1样品中富集蛋白的GO分析。数据显示重要的GO术语与染色质组织，重塑和基因表达的表观遗传控制有关。使用元景观执行的分析。C) Anti-FLAG western blot检测H2A-HA-Cfa的表达N-FLAG和H2A-E92K-HA-CfaN国旗。以考马斯蓝染色可见的H4作为加载对照。D)在Cfa存在下H2A (WT)和H2A (E92K)结构物的核内剪接反应C-Ir(称为Int)和对照(如anti-HA和anti-FLAG western blot所示)。以考马斯蓝染色可见的H4作为加载对照。MW的H2A-HA-CfaN-FLAG = 28,121 Da。印迹源数据参见补充图。1．
图2酸性斑块三突变体相互作用组及与H2A E92K的比较。
A)左:Anti-FLAG western blot检测H2A-HA-Cfa的表达N-FLAG和hha - 3xala - ha - cfaN国旗。注:3xAla为H2A中E61A、E90A、E92A酸性斑块突变。右图:在Cfa存在下，H2A (WT)和H2A (3xAla)结构物的核内剪接反应C-Ir经anti-HA和anti-FLAG western blot检测。B) H2A (WT)和H2A (3xAla)对比实验的图示。C)火山图来自双侧t检验，显示使用µMap工作流在H2A (WT)和H2A (3xAla)之间的比较蛋白质组学研究中富集的蛋白质。突出显示的蛋白质代表酸性斑块粘结剂和染色质重塑剂，并根据它们所属的重塑复合物进行颜色编码。FDR值使用Benjamini-Hochberg程序计算，如方法中所述。D)表显示了H2A (WT)和H2A (3xAla)之间在µMap数据集中富集的已知染色质重塑复合物。蛋白质通过富集进行颜色编码。蓝色=日志2Fc >0.5, FDR <0.05。青色=满足FDR要求，FDR <0.05。红色=不丰富。黑色=不在数据集中。数据显示，大多数(80%)复合体成员的核小体结合受到H2A酸性斑块缺失的影响。E)显示H2A (WT) vs H2A (E92K)和H2A (WT) vs H2A (3xAla)数据集中功能蛋白损失重叠的维恩图。大约三分之二的点击率(Log2在H2A (E92K)实验中观察到的FC >0.5, FDR <0.05)在H2A (3xAla)实验中也是命中的。印迹源数据参见补充图。1．
图3转染组蛋白H3.1相对数量的测定。
A)具有代表性的western blot显示原生H3和转染H3.1-HA-Cfa的相对浓度N国旗。B)显示转染H3和原生H3相对强度的柱状图。N = 6个独立生物学重复，(**** = P < 0.0001)。超过6个重复的转染组蛋白约占所有组蛋白H3的1/12。印迹源数据参见补充图。1．
图4稳定细胞系蛋白质组学数据的比较。
为了比较稳定表达对µMap的影响，我们在表达hha - ha - cfa的HEK 293T细胞中进行了两种核心工作流程N-FLAG和/或H2A(E92K)-HA-CfaN国旗。A) Anti-FLAG western blot显示H2A-HA-Cfa稳定表达N-FLAG和H2A(E92K)-HA-CfaN-FLAG在指定的病毒滴度。Ponceau染色作为负载对照。B)左:火山图来自双侧t检验，显示在稳定表达细胞中含有1 μ M JQ-1的JQ-1的µMap靶ID实验。数据与瞬时转染的细胞系一致。右图:火山图来自双侧t检验，显示µMap实验，比较野生型和E92K相互作用组。C)瞬时转染细胞与稳定表达细胞的H2A (WT) vs H2A (E92K)蛋白质组命中的比较。表显示了本研究中研究的四种蛋白质。D)维恩图，显示数据集之间的所有共同蛋白质(Log2Fc >0.5, FDR <0.05)。在关键染色质修饰蛋白中观察到重叠。印迹源数据参见补充图。1．
图5 ATAC-Seq扩展数据。
A)分层聚类分析:使用合并峰中的读计数来计算样本之间的距离，生成样本到样本关系的热图。数据显示复制之间有很强的相关性。B)差分绑定分析:R包DiffBind用于差分感兴趣区域(ROI)检测，以FDR <= 0.05为截止值。折叠变化小于零且FDR <= 0.05的峰值表示可达性较低的区域。折叠变化大于零且FDR <= 0.05的峰为可达性较高的区域。C)注释转录起始位点(TSS’s)上所有样本的ATAC-seq平均谱线:数据显示ATAC-seq峰的平均谱线位于全基因组注释TSS位点的+/−3Kb内。D)差异峰标注:峰的标注基于重叠的基因组特征。当注释重叠时，分配优先级为启动子> 5'UTR > 3'UTR >外显子>内含子>下游>基因间。E)合并峰下重叠特征直方图，按峰数排序。F)从峰顶到最近TSS的基因组距离分布。
扩展数据图6 APEX2比较-验证。
μMap与APEX方法的比较:A)本研究中的关键实验采用先前报道的APEX2方法，根据已发表的程序进行重复:Hung, V.， Udeshi, N.， Lam, S.等。用工程过氧化物酶APEX2在活细胞中的空间解析蛋白质组学制图。Nat协议11， 456-475 (2016)．10.1038 / nprot.2016.018。B) Western blot显示分馏的细胞核、细胞质和膜蛋白组中生物素化的相对水平。数据显示，APEX结构定位于细胞核。C) Western blot显示来自9-plex实验的数据，代表两个不同的实验(H2A (WT) vs. H2A (E92K)和H2A±JQ-1;每个N = 3)。H2A-APEX2的表达和生物素化水平在所有重复中均相同。MW: hah - ha - apex2 - flag = 41,981 Da。D) H2A-APEX或H2A-Cfa转染HEK 293T细胞的分离N表明表达的ha标记组蛋白融合蛋白定位于染色质部分。左)Anti-HA western blot显示H2A-HA-APEX2-FLAG在不同细胞部位的定位。提供了适当的加载控制。右)Anti-HA western blot显示H2A-HA-CfaN-FLAG定位到不同的细胞部分。提供了适当的加载控制。E)火山图来自双侧t检验，显示APEX2接近标记和H2A (WT) vs H2A (E92K)的µMap实验结果的比较。F)使用APEX2和铱偶联核小体检测相互作用体的模型。µMap的短半径只允许标记直接与表达的核小体相互作用的蛋白质。APEX2的更长的半径导致与表达组蛋白相邻的野生型核小体相互作用体的额外标记，导致信号对噪声的显著降低。印迹源数据参见补充图。1．
扩展数据图7 H2A±JQ-1和Pinometostat的支持数据。
一)在?H2A-Cfa的剪接反应N在Cfa的存在下构造C-Ir如anti-HA/anti-FLAG western blot所示。左(未处理的细胞)，中(JQ-1处理的细胞)，右(Pinometostat处理的细胞)。MW的H2A-HA-CfaN-FLAG = 28,121 Da。B)用pinometostat处理HEK 293T细胞24小时(0,0.5,2.5 μM)， H3K79二甲基化降低约60%，通过抗h3k79me2抗体western blotting可见。用考马斯蓝染色的组蛋白H3、H2A和H2B作为加载对照。C)火山图来自于比较APEX2目标ID接近标记与µMap目标ID H2A±JQ-1的双侧t检验。D)火山图来自于两种不同处理浓度(5µM(左)和1µM(右))比较H2A±JQ-1的双侧t检验。E)对比观测到的测井曲线2(倍数变化)BRD2/3/4在指定处理浓度下返回的值。印迹源数据参见补充图。1．
图8 RNA-Seq数据。
A)比较各组间的整体转录变化(WT vs JQ-1)通过双侧t检验得出的火山图进行可视化。散点图中的每个数据点代表一个基因。日志2x轴表示每个基因的变化倍数，y轴表示调整后的p值的log10。调整后p值小于0.05且有对数的基因2大于1的折叠变化用红点表示。这些代表着上调的基因。调整后的p值小于0.05且log2倍变化小于−1的基因用蓝点表示。这些代表下调的基因。B)采用双聚类热图(bi-clustering heatmap)，通过绘制它们的日志，可视化按调整后的p值排序的前30个差异表达基因(WT vs JQ-1)的表达谱2转换后的样本表达式值。该分析有助于识别不同处理条件下的共调控基因。C&D)对(WT vs Pinometostat)样品进行了相同的分析。E)显示H2A vs H2A +JQ-1实验中RNA-seq折叠变化和蛋白质组命中P值的表格。数据有力地表明，基因的富集是由于邻近性，而不是基因表达的全球变化。F) H2A vs H2A +松紧素实验中RNA-seq折叠变化和蛋白质组命中P值的表格。重要的是，蛋白质组学分析中富集的基因并没有在RNA-seq中富集，这表明富集是基于接近性，而不是配体处理引起的基因表达变化。
扩展数据图9 RBP1表达验证和剪接。
左:Anti-HA western blot检测RBP1-HA-Cfa的表达N国旗。以考马斯蓝染色可见的H4作为加载对照。中间:在?RBP1-HA-Cfa的剪接反应N-FLAG在Cfa面前C-生物素(+)可见链霉亲和素-800。以考马斯蓝染色可见的H4作为加载对照。右图:安装Ir光催化剂(用蓝色led照射45和90秒)后核蛋白的标记，与链霉亲和素-800所示的游离Ir对照。MW的RBP1-HA-CfaN-FLAG = 231,290 Da。印迹源数据参见补充图。1．
扩展数据图10用两种独特的肽过滤器分析所有蛋白质组学实验的火山图。
火山图来源于MS实验的双侧t检验。所有蛋白质都需要在所有重复中找到两个独特的多肽。切断是原木2FC >0.5, FDR <0.05。印迹源数据参见补充图。1．
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引用本文
Seath, c.p.， Burton, a.j.， Sun, X。et al。利用纳米级光接近标记跟踪染色质状态的变化。自然(2023)。https://doi.org/10.1038/s41586-023-05914-y
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