文摘
同源重组(人力资源)实现一个关键的角色在DNA双链断裂的修复和倒塌的复制叉1。人力资源取决于几个paralogues的产品RAD51,包括四聚物的复杂RAD51B RAD51C RAD51D和XRCC2 (BCDX2)2。BCDX2函数作为核蛋白质纤维组装的中介RAD51和单链DNA (ssDNA)在人力资源,但其机制仍是未定义的。这里我们报告低温电子显微镜重建人类BCDX2 apo和ssDNA-bound状态。结构揭示RAD51B伴域,如何RAD51C RAD51D参与inter-subunit交互支撑复杂的形成和ssDNA-binding特异性。单分子DNA窗帘收益率分析深入了解BCDX2增强RAD51-ssDNA核蛋白质纤维组装。此外,我们的低温电子显微镜和功能分析解释RAD51C改变癌症患者中发现的3,4,5,6灭活DNA结合和BCDX2的人力资源中介活动。我们的研究结果揭示BCDX2在人力资源中的作用,并提供一个基础了解致病基因修复BCDX2变化的影响。
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原子坐标apo BCDX2和BCDX2-ssDNA复合物结构生物信息学研究合作实验室的PDB加入代码8《法兰克福汇报》和8 gbj,分别。相应的低温电子显微镜地图已经存入电子显微镜数据银行加入数字emd - 28961(apo BCDX2)和emd - 29917(BCDX2-ssDNA)。研究合作实验室的使用结构数据结构生物信息学在PDB7 ejc和PDB7倘使。源数据本文提供的。
引用
唱,p & Klein h .同源重组的机制:介质能够承担监管职能。Nat。启摩尔。细胞杂志。7,739 - 750 (2006)。
沙利文,m . r . &伯恩斯坦k . RAD-ical RAD51监管的新见解。基因https://doi.org/10.3390/genes9120629(2018)。
Meindl, a . et al .遗传突变在乳腺癌和卵巢癌谱系建立RAD51C作为一个人类癌症易感基因。Nat,麝猫。42,410 - 414 (2010)。
Kondrashova, o . et al .二级体细胞突变恢复RAD51C和RAD51D与获得性耐药的PARP抑制剂rucaparib中高档卵巢癌。癌症。7,984 - 998 (2017)。
Garcin e . b . et al .微分要求RAD51假字在人类细胞的基因组修理和维护。公共科学图书馆麝猫。15e1008355 (2019)。
普拉卡什,r . et al .同源recombination-deficient突变聚集在肿瘤抑制。Proc。《科学。美国119年e2202727119 (2022)。
克拉克,t . l . & Mostoslavsky r DNA修复作为共享在癌症和老化的标志。摩尔。杂志。16,3352 - 3379 (2022)。
普拉卡什,R。张,Y。,Feng, W. & Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins.冷泉哈布。教谕。医学杂志。7a016600 (2015)。
Sigurdsson, S。特鲁希略,K。、歌曲、B。,Stratton, S. & Sung, P. Basis for avid homologous DNA strand exchange by human Rad51 and RPA.生物。化学。276年,8798 - 8806 (2001)。
赵,w . et al。促进BRCA2-dependent同源重组DSS1通过狙击枪瞄准和DNA拟态。摩尔。细胞59,176 - 187 (2015)。
马森,j . y . et al .识别和净化两种截然不同的复合物包含五个RAD51假字。Dev的基因。15,3296 - 3307 (2001)。
马蒂诺,j . et al。人类的蜀复杂函数PDS5B和SPIDR促进同源重组。核酸Res。47,10151 - 10165 (2019)。
Yonetani, y . et al .微分和协作的行为Rad51间接同源蛋白质在细胞DNA损伤反应。核酸Res。33,4544 - 4552 (2005)。
Nalepa、g和克拉普,d . w . Fanconi贫血和癌症:一个错综复杂的关系。Nat。启癌症18,168 - 185 (2018)。
Jacquinet, et al。扩大FANCO / RAD51C相关的表型:唇腭裂和大叶性前脑无裂畸形,两个罕见的发现Fanconi贫血。欧元。j .地中海,麝猫。61年,257 - 261 (2018)。
Vaz, f . et al .突变的RAD51C基因在Fanconi anemia-like障碍。Nat,麝猫。42,406 - 409 (2010)。
Shamseldin h·E。,Elfaki, M. & Alkuraya, F. S. Exome sequencing reveals a novel Fanconi group defined by XRCC2 mutation.j .地中海,麝猫。49,184 - 186 (2012)。
米勒,k。Sawicka D。,Barsky, D. & Albala, J. S. Domain mapping of the Rad51 paralog protein complexes.核酸Res。32,169 - 178 (2004)。
徐,j . et al。独特的机制不匹配之间的宽容Rad51和同源重组的一代。核酸Res。49,13135 - 13149 (2021)。
佩莱格里尼,l . et al .洞察DNA重组RAD51-BRCA2复杂的结构。自然420年,287 - 293 (2002)。
Rajendra,大肠& Venkitaraman a。r . BRC重复的两个模块BRCA2调解与RAD51重组酶结构和功能的相互作用。核酸Res。38,82 - 96 (2010)。
Yu, d . s . et al .动态控制Rad51重组酶与BRCA2 self-association和交互。摩尔。细胞12,1029 - 1041 (2003)。
短,j . m . et al .突触前的高分辨率结构RAD51灯丝电子cryo-microscopy单链DNA。核酸Res。44,9017 - 9030 (2016)。
徐,j . et al .低温电子显微镜结构人类RAD51重组酶催化dna链交换期间细丝。Nat。结构。摩尔。杂志。2440-46 (2017)。
气,P。,Van Komen, S., Sehorn, M. G., Sigurdsson, S. & Sung, P. Roles of ATP binding and ATP hydrolysis in human Rad51 recombinase function.DNA修复5,381 - 391 (2006)。
沙利文,m . r . et al .长期生存的卵巢癌病人窝藏RAD51C错义突变。冷泉哈布。摩尔。螺栓。https://doi.org/10.1101/mcs.a006083(2021)。
松尾Y。,Sakane, I., Takizawa, Y., Takahashi, M. & Kurumizaka, H. Roles of the human Rad51 L1 and L2 loops in DNA binding.2月J。273年,3148 - 3159 (2006)。
杨,H。,Zhou, C., Dhar, A. & Pavletich, N. P. Mechanism of strand exchange from RecA-DNA synaptic and D-loop structures.自然586年,801 - 806 (2020)。
吉布,B。,Silverstein, T. D., Finkelstein, I. J. & Greene, E. C. Single-stranded DNA curtains for real-time single-molecule visualization of protein-nucleic acid interactions.肛交。化学。84年,7607 - 7612 (2012)。
吉布,b . et al .单链DNA的复制的蛋白质浓度交换了单分子成像。《公共科学图书馆•综合》9e87922 (2014)。
妈,c . J。,吉布,B。,Kwon, Y., Sung, P. & Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.核酸Res。45,749 - 761 (2017)。
妈,c . J。,Steinfeld, J. B. & Greene, E. C. Single-stranded DNA curtains for studying homologous recombination.Enzymol方法。582年,193 - 219 (2017)。
跳投,j . et al .高度精确和AlphaFold蛋白质结构预测。自然596年,583 - 589 (2021)。
Gayarre, j . et al。小说的描述有害RAD51C p。Arg312Trp变体和优先级标准的功能分析RAD51C错义变化。Br。j .癌症117年,1048 - 1062 (2017)。
Belan, o . et al .单分子分析揭示了合作刺激中介Rad51丝成核和生长的蛋白质。摩尔细胞81年,1058 - 1073 (2021)。
罗伊,et al。Rad51假字复杂Rad55-Rad57作为分子伴侣蛋白同源重组。摩尔。细胞81年,1043 - 1057 (2021)。
Špirek, M。,Taylor, M. R. G., Belan, O., Boulton, S. J. & Krejci, L. Nucleotide proofreading functions by nematode RAD51 paralogs facilitate optimal RAD51 filament function.Commun Nat。125545 (2021)。
Punjani,。,Rubinstein, J. L., Fleet, D. J. & Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.Nat方法。14,290 - 296 (2017)。
佩特森工作室内由手工制作完成,e . f . et al . UCSF ChimeraX:结构可视化研究人员、教育工作者,和开发人员。蛋白质科学。30.,70 - 82 (2021)。
Emsley p &卡谭,k .傻瓜:模型分子图形的工具。Acta Crystallogr。D60,2126 - 2132 (2004)。
Liebschner说道,他致力于小到d . et al .大分子结构的决心使用x射线、中子和电子:凤凰的近期发展。Acta Crystallogr。D75年,861 - 877 (2019)。
德拉诺,w . PyMOL分子图形系统http://www.pymol.org(德拉诺科学,2002)。
盖恩斯,w·a . et al .促进突触前纤维组装的合奏酿酒酵母Rad51 paralogues Rad52。Commun Nat。67834 (2015)。
德图里奥,L。,Kaniecki, K. & Greene, E. C. Single-stranded DNA curtains for studying the Srs2 helicase using total internal reflection fluorescence microscopy.Enzymol方法。600年,407 - 437 (2018)。
格林,e . C。、风能、S。,Fazio, T., Gorman, J. & Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.Enzymol方法。472年,293 - 315 (2010)。
罗伊,&格林·e·c .单链DNA单分子可视化的窗帘Rad51-ssDNA灯丝动力学。摩尔。生物方法。2281年,193 - 207 (2021)。
确认
感谢实验室的另外的成员E.C.G.和S.K.O.讨论。研究报告在这个出版得到了国家卫生研究院的基金,R01 GM115568 R01 GM128731 (S.K.O.);R01 CA168635、R01 ES007061 P01 CA92584和R35 CA241801(注:);R00 GM140264 (E.V.W.);R01 CA221858和R35 GM118026 (E.C.G.);R01 GM141091和显示- 22 - 721675 - 01 - dmc (W.Z.);R01 CA246807和R01 CA258381 (S.B.);R01 GM136717、R01 CA23728 R01 CA188347和国会指导医学研究项目BC191160 (A.V.M.);R50 CA265315 (Y.K.);R35 CA253174 (M.J.); R01 ES030335, ES031796 and the Department of Defense BC201356 (K.A.B.); and R01 CA139429 and Cancer Prevention and Research Institute of Texas RP220269 (R.H.). P.S. is the holder of the Robert A. Welch Distinguished Chair in Chemistry (AQ-0012) and the recipient of a CPRIT REI Award (RR180029). A.V.M. is the holder of the Joe R. and Teresa Lozano Long Chair in Cancer Research and is the recipient of a CPRIT REI Award (RR210023). S.K.O. is the recipient of a CPRIT Rising Star Award (RR200030), and E.V.W. is the recipient of a CPRIT Recruitment of First Time Tenure Track Faculty Award (RR220068). E.C.G. is a recipient of a Wellcome Trust Collaborative Award in Science (206292/D/17/Z). The cryo-EM data used for the BCDX2 reconstruction were collected at the UT Health San Antonio Cryo-EM Facility on a Glacios transmission electron microscope equipped with a Falcon IV camera and a Selectris energy filter purchased with the support of University of Texas STARs awards 402-1288 (P.S.) and 402-1317 (S.K.O.). We thank A. Brilot for assistance screening cryo-EM grids at the University of Texas at Austin Sauer Structural Biology Laboratory (RRID:SCR_022951). We thank B. Hunter at the UT Health San Antonio Electron Microscopy Laboratory of South Texas Reference Laboratories, Department of Pathology and Laboratory Medicine, for assistance with negative-stain EM. The SPR assay was carried out in the Center for Innovative Drug Discovery and the Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource supported by CPRIT Core Facility Award RP160844 (D.Z.) and NIH-NCI P30 CA054174 (S.K.O. and D.Z.), respectively. The content of this study is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the NIH.
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作者和联系
贡献
蛋白质是由Y.R.净化和香港第50结构进行了试验和分析,E.A.R.,E.V.W.和S.K.O. Y.R. conducted biochemical, mass photometry and negative-stain EM assays. S.Z. conducted SPR assays. A.M. conducted single-molecule experiments. K.A.B., M.J., Y.K., R.H., A.B.T., S.B., A.V.M., W.Z. and D.Z. assisted with experimental design and data interpretation. The figures and manuscript were prepared by Y.R., L.J., A.M., Y.K., E.V.W., E.C.G., P.S. and S.K.O., with input from all authors.
相应的作者
道德声明
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
同行评审
同行审查的信息
自然感谢匿名评论者对他们的贡献的同行评审工作。同行审查报告是可用的。
额外的信息
出版商的注意施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。
扩展数据数据和表
扩展数据图1 BCDX2 apo结构的调整和低温电子显微镜数据处理流程图。
一个,分析凝胶过滤色谱BCDX2复杂的ATP / Mg的存在2 +10/300 Superdex200增加列上表达和纯化中描述方法(前)。Coomassie-stained表示分数代表多个复制的sds - page凝胶(底)。b,质量BCDX2光度法分析复杂的净化在(红色)和ATP和Mg缺席(蓝色)2 +。两个样本数据采集前立即迅速稀释成PBS。c首次按三轮,Auto-picked粒子二维分类、六初始模型是第一个然后四轮异构细化紧随其后。严格的异构的最后一步细化和紧密的面具均匀细化导致最后一个高分辨率的地图。所有的数据进行了分析使用Cryosparc v3.3.1。
扩展数据图2 apo BCDX2复杂的低温电子显微镜重建的质量。
一个,最终的欧拉角分布的粒子用于3 d细化。b情节,傅里叶壳牌相关(FSC)从两个一半地图,整体分辨率为2.3 0.143标准的确定。c,当地解决地图的颜色(红色)更低,高分辨率(蓝色)。d整体图(左)和详细视图的本地低温电子显微镜BCDX2密度为选定区域的复杂(正确的)。e低温电子显微镜BCDX2复杂的地图,两个视图相关的180°旋转的轴(左)。各个子单元显示的地图正确的与RAD51B(粉红色),RAD51C(绿色),RAD51D(黄色),XRCC2(紫色)。
扩展数据图3 Subunit-subunit BCDX2复杂交互网络。
一个表示的,卡通表示RAD51B / RAD51C接口与残留参与分子间的相互作用表现为。显示了复杂的概述左放大视图的显示接口提出了三个正确的面板。罪犯,并给出了表示复合物板一个RAD51C / RAD51D (面板b),RAD51D / XRCC2 (面板c从突触前纤维)和RAD51 / RAD51 (PDB:7 ejc)(面板d)。eg,基于结构的表示蛋白质的序列比对。残留左边的数字序列,二级结构元素(RAD51作为参考)所示的序列。联系人RAD51(阴影青色),RAD51B(鲑鱼),RAD51C(绿色),RAD51D(黄金),和XRCC2(红色)。在面板g单色显示atp酶域接触,被忽视的热带病和盒装阴影区域表示联系人链接器。h完整的、表面静电表示BCDX2复杂的atp酶域RAD51B建模使用AlphaFold和残留组成的基本块作为假定的核酸结合位点标记。
扩展数据图4的结构特点和功能分析BCDX2单元活动网站。
一个,概述BCDX2结构显示为一个半透明的卡通。ATP和BCDX2残留联系ATP显示为固体棒(中心)。活跃的站点都是盒装的。放大视图BCDX2活跃的网站显示在左边和右边面板。b,基于结构的ATP结合位点的序列比对BCDX2子单元和RAD51。核苷酸埋在单元之间的接口和主ATP结合位点被定义为子单元的沃克主题联系ATP,二级ATP结合位点被定义为子单元贡献互动残留的另一面ATP。互动残留的主要和次要ATP结合位点的颜色为绿色和粉红色,分别。RAD51 (PDB:7 ejc)供参考。c1μm, atp酶化验显示BCDX2变体的存在与否ssDNA 60分钟后孵化。π表示无机磷酸盐水解后释放。直方图显示结果从三个独立的实验,数据给出平均值±SD和p价值观的意义差异的平均值的计算是通过双边t检验显示。d。ATP水解1μM WT,表示突变BCDX2复合物有或没有ssDNA表示时间点进行评估,为三个独立的实验绘制测量平均值±SD。腺苷三磷酸酶图片板c和d来自相同的实验和并行处理。
扩展数据图5低温电子显微镜BCDX2 / ssDNA结构数据处理流程图。
Auto-picked首次按三轮2 d粒子分类。接下来,六个初始模型生成,紧随其后的是四轮异构提纯。严格的异构的后续步骤细化和紧密的面具均匀细化3.12类3导致地图的分辨率。最后一个非均匀细化收益率最终决议3.11地图。所有的数据处理进行了使用Cryosparc v3.3.1。
扩展数据图6 BCDX2-ssDNA复杂的低温电子显微镜重建的质量。
一个,最终的欧拉角分布的粒子用于3 d细化。b情节,傅里叶壳牌相关(FSC)从两个一半地图,整体分辨率为3.1 0.143标准的确定。c,当地解决地图的颜色(红色)更低,高分辨率(蓝色)。d整体图(左)和详细视图的地方AMP-PNP低温电子显微镜密度和ssDNA BCDX2 / ssDNA结构(正确的)。e低温电子显微镜BCDX2复杂的地图,两个视图相关的180°旋转的轴(左)。各个子单元显示的地图正确的与Rad51B(粉红色),Rad51C(绿色),Rad51D(黄色),XRCC2(紫色),ssDNA(青色)。
扩展数据图7 A BCDX2 ssDNA绑定特异性的潜在机制。
一个,从BCDX2 RAD51C叠加到RAD51 RAD51 / ssDNA突触后结构(PDB:7倘使)。三个子单元从RAD51灯丝。概述的叠加显示在中心面板,而放大的视图RAD51C / RAD51D和RAD51D / XRCC2复形的显示正确的和左,分别。b放大视图RAD51D / XRCC2模块的面板,对y轴旋转180度(左)。正确的复杂,dsDNA RAD51 / dsDNA突触后显示为球体RAD51结构省略的清晰度。注意dsDNA之间的冲突和XRCC2由于11和23度倾斜RAD51C / RAD51D和RAD51D / XRCC2接口,分别与RAD51相比。c、表面的静电表示与dsDNA BCDX2复杂的叠加a和b板。注意dsDNA和XRCC2之间的冲突和近距离的“NTDs BCDX2 dsDNA。”dXRCC2到RAD51叠加。注意结构差异在长度和构象的循环1地区包括螺旋H12 H14,对阵dsDNA的模型。
扩展数据图8的比较腺苷三磷酸酶/ atp酶域交互BCDX2 RAD51。
得了氨基酸的分析交互网络的腺苷三磷酸酶/ atp酶接口RAD51C / RAD51D (板一个),RAD51D / XRCC2 (面板bBCDX2)复形,RAD51 /从RAD51 RAD51 ssDNA突触前纤维复杂(PDB:7 ejc)(面板c)。结构显示为卡通交涉残留参与分子间的相互作用表现为。两个视图相关的复合物的180度旋转的轴顶部和底部面板所示。d,基于结构的序列比对突出atp酶域/ atp酶域交互接口中突出显示面板得了。残留彩色的亚基相互作用:RAD51C(绿色),RAD51D(黄金),XRCC2(红色)和RAD51(青色)。的腺苷三磷酸酶领域RAD51B BCDX2结构中不可见,但包含在序列比对的比较。
扩展数据图9描述BCDX2重组中介活动。
一个有代表性的单ssDNA分子(波动曲线记录仪左面板)显示GFP-BC + DX2 + ATP(复制从无花果。4为比较),GFP-BC + DX2 - ATP,公元前+ GFP-DX2 - ATP, GFP-BC + DX2加上ATPγS GFP-BC + DX2(绿色通道;10 nM每个蛋白质复合体)+ AMP-PNP(2.5毫米ATP或ATP模拟)绑定到mCherry-RPA-ssDNA(红色通道)。图(右面板)显示量化mCherry-RPA-ssDNA GFP-BCDX2绑定。GFP-BC + DX2的图复制从无花果。4 b进行比较。数据被表示为意味着规范化GFP信号强度;误差线代表95%可信区间。数据来自三个流动细胞/反应条件。b有代表性的单ssDNA分子(波动曲线记录仪左面板从图)显示GFP-BC + DX2(复制。4为比较),GFP-BC-R258H + DX2 GFP-BC-R312W + DX2 (10 nM每个蛋白质复合体)的2.5毫米ATP和逃避mCherry-RPA-ssDNA绑定。图(右面板)显示量化mCherry-RPA-ssDNA GFP-BCDX2绑定。GFP-BC + DX2图(+ ATP)从图复制。4 b进行比较。数据被表示为意味着规范化GFP信号强度;误差线代表95%可信区间。数据导出使用三个流细胞/反应条件。c,代表单一RPA-ssDNA分子的波动曲线记录仪显示GFP-BC + DX2的行为反应与ATP (离开波动曲线记录仪),ATPγS (中心波动曲线记录仪)和AMP-PNP (正确的波动曲线记录仪)在RAD51灯丝组装。dRAD51丝装配中,量化mCherry-RPA离解的存在和缺乏BCDX2 (左面板),如表示。数据代表的意思是规范化mCherry信号强度。数据导出使用三个流细胞/反应条件。计算利率RPA-mCherry离解从ssDNA RAD51灯丝大会右面板)。误差线代表95%可信区间。每个数据集n = 3流细胞;p值的计算是通过未配对t检验(两面)。
扩展数据图10 BCDX2功能的生物物理和生物化学特征。
一个代表显微图描绘RAD51核蛋白质纤维被负染色电镜在缺席或BCDX2, CDX2和BCDX2 RAD51C突变体R258H R312W。为每个样本数据代表至少40电子显微图捕捉到两个独立的实验。b, c,大规模的光度法分析RAD51相互作用(面板b)BCDX2复杂,(面板c公元前)复形的ATP /毫克2 +。情节代表分子质量档案RAD51 BCDX2,公元前和公元前RAD51当混合BCDX2或不同的颜色编码和分子质量每个样本中最突出的峰。d的两个原体片段RAD51突触前纤维(在石板和RAD51.2 RAD51.1青色)叠加在XRCC2亚基BCDX2 XRCC2单元的复杂。总体模型所示左面板和放大视图的ATP结合位点之间的接口XRCC2 RAD51.1所示右面板。注意XRCC2β8链的延长一些残留物和β7之间的循环和β8阿迪普显著不同的构象RAD51与ATP的冲突的模型。e,ATP水解1μM WT,表示突变BCDX2复合物有或没有ssDNA表示时间点进行评估,为三个独立的实验绘制测量平均值±SD。腺苷三磷酸酶图片来自相同的实验和并行处理。
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拉瓦尔大声回答,Y。贾,L。,Meir, A.et al。在同源重组结构洞察BCDX2复杂函数。自然(2023)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06219 - w
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DOI:https://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06219 - w
