FSP1促进ferroptosis相分离gydF4y2Ba

Ferroptosis,代谢non-apoptotic细胞死亡形式的特点是iron-dependent脂质过氧化反应,只在最近才被定义gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba}。Ferroptosis吸引了极大的兴趣,因为其高相关人类疾病如神经退行性疾病,在寒冷暴露组织损伤,ischaemia-reperfusion损伤和癌症gydF4y2Ba^{9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba}。特别是,触发ferroptosis上下文中的恶性肿瘤已经成为一个非常有前途的方法显示协同效应与癌症免疫疗法,甚至杀死therapy-resistant和转移性癌症gydF4y2Ba^{2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba}。我们最近表明,FSP1代表了一个强大的备份系统ferroptosis的《卫报》,称为GPX4,呈现抗肿瘤抑制的节点gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba}。然而,由于第一个描述FSP1-specific抑制剂iFSP1 (ref。gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba)不符合进一步发展作为抗癌药物,由于其有限的潜在药物化学发展的一个不利的结构和替换模式gydF4y2Ba^16gydF4y2Ba下一代,有效的体内FSP1抑制剂治疗肿瘤是迫切需要的。gydF4y2Ba

识别可能vivo-applicable FSP1-specific抑制剂作为未来潜在的药物治疗难治性癌症,我们仔细地重新检验它的化合物从~ 10000药物类小分子化合物(如前所述gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba)药物化学发展的潜在使用cheminformatics工具gydF4y2Ba^17gydF4y2Ba预测的物理化学性质和drug-likeness。点击验证研究确定的类3-phenylquinazolinones(铅复合icFSP1)所代表的一类的有力药理抑制剂FSP1(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。初步的结构活性关系的研究尚未确定化合物与实质性改进icFSP1(扩展数据图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。icFSP1治疗引起的脂质过氧化和ferroptotic细胞死亡有关4-hydroxytamoxifen (TAM)诱导gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba敲除老鼠Pfa1细胞gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba稳定overexpressing人类FSP1 (hFSP1)和在人类纤维肉瘤细胞株ht - 1080(无花果。gydF4y2Ba1 b-ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。icFSP1-induced细胞死亡被ferroptosis抑制剂救起,但不是通过抑制剂针对其他形式的细胞死亡,从而确认其ferroptosis的特异性。杀害(癌症)细胞通过瞄准FSP1通常需要co-treatment与其他类型的规范ferroptosis抗病诱导剂gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}我,如系统gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba抑制剂erastin谷氨酸,半胱氨酸连接酶(GCL)抑制剂gydF4y2BalgydF4y2Ba-buthionine sulfoximine (BSO), GPX4抑制剂(1gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba3gydF4y2BaRgydF4y2Ba)-RSL3 (RSL3), ML210 FIN56,以及铁氧化复合FINO2(参考文献。gydF4y2Ba^{1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba}),但不是化合物诱导其他形式的细胞死亡(扩展数据图。gydF4y2Ba1汉英gydF4y2Ba)。因此,这是奇怪的治疗ht - 1080细胞,与icFSP1 ferroptosis中的主要细胞模型研究,单独或doxycycline-induciblegydF4y2BaFSP1gydF4y2Ba72 h足以引发ferroptosis淘汰赛(无花果。gydF4y2Ba1 dgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba1 f-hgydF4y2Ba),与一组不同的人类癌症细胞系(扩展数据图。gydF4y2Ba1 cgydF4y2Ba)。地址是否icFSP1脱靶效应,ht - 1080和主要HEK293T细胞和外周血单核细胞(PBMCs)暴露在FSP1抑制剂(icFSP1和iFSP1) 72 h和24 h,分别。在这些实验中,icFSP1没有显示脱靶效应甚至在更高浓度与iFSP1(扩展数据图。gydF4y2Ba1 h-jgydF4y2Ba)。除此之外,gydF4y2BaFSP1gydF4y2Ba脱细胞处理浓度增加icFSP1没有显示任何额外的协同效应,当细胞co-incubated GPX4抑制剂(扩展数据图。gydF4y2Ba1 k, lgydF4y2Ba),这表明icFSP1应该被认为是一个选择性FSP1抑制剂。gydF4y2Ba

调查是否icFSP1也诱发死亡在非人类细胞中,我们包含了两个不同的鼠标细胞系和一个在我们的研究中鼠成纤维细胞系(4 t1, B16F10 Rat1,分别),表明co-treatment RSL3或gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba淘汰赛未能实现协同杀死这些细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba2 ggydF4y2Ba)。符合这一点,脂质过氧化和细胞生存能力没有受到icFSP1gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba淘汰赛Pfa1细胞稳定overexpressing鼠标FSP1 (mFSP1;扩展的数据图。gydF4y2Ba2 h,我gydF4y2Ba),这表明icFSP1专门抑制人类同种型。此外,我们测试了其他orthologues Pfa1 FSP1的细胞,overexpressing FSP1gydF4y2Ba背带吊裤带gydF4y2Ba(鸡),gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍光滑的gydF4y2Ba(青蛙)。尽管FSP1表达式(从除外gydF4y2BaX。gydF4y2Ba光滑的gydF4y2Ba)完全阻止RSL3-induced ferroptosis, icFSP1减少细胞生存能力只有在细胞overexpressing hFSP1(扩展数据图。gydF4y2Ba2 j-lgydF4y2Ba)。因此这些数据强化了这一观念,icFSP1 hFSP1-specific抑制剂。gydF4y2Ba

调查这些下一代FSP1抑制剂的作用机制,FSP1的直接抑制活性测定体外通过使用与hFSP1重组酶(图建立了测定。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。而hFSP1的酶活性被抑制iFSP1在无细胞系统中,报道gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba},icFSP1没有抑制hFSP1 low-micromolar范围的活动,虽然它显然影响细胞的生存能力和Pfa1细胞脂质过氧化overexpressing hFSP1(无花果。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3 a - kgydF4y2Ba)。事实上,估计half-maximal抑制浓度(ICgydF4y2Ba_50gydF4y2BaicFSP1)的体外测定(酶)超过100倍高于half-maximal有效浓度(ECgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba(图)中观察到Pfa1细胞。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba3我gydF4y2Ba)。这些结果强烈认为icFSP1,与iFSP1相比,使用不同的作用机制抑制hFSP1活动的细胞。gydF4y2Ba

阐明作用机制,我们首先分析了icFSP1是否可能减少hFSP1的表达水平。免疫印迹的hFSP1-expressing H460细胞或ht - 1080 icFSP1治疗后48 h和72 h显示表达水平的hFSP1并不影响icFSP1治疗(扩展数据图。gydF4y2Ba3 l-ngydF4y2Ba)。接下来,我们认为icFSP1可能会改变hFSP1的亚细胞定位从脂质膜分离,从而防止其anti-ferroptotic清除磷脂的功能通过泛醌自由基和/或维生素E或KgydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba}。为此,hFSP1融合增强型绿色荧光蛋白和链霉亲和素(hFSP1-EGFP-Strep)稳定在Pfa1细胞及其在应对icFSP1定位监测治疗。与iFSP1 hFSP1-EGFP-Strep icFSP1明显改变了亚细胞定位,说明了不同的焦点和细胞冷凝物的外观(图gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba,扩展数据图。gydF4y2Ba3 ogydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这些冷凝物堆积在细胞以时间依赖方式(无花果。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba),只发生在细胞表达hFSP1而不是在那些表达mFSP1(扩展数据图。gydF4y2Ba3 pgydF4y2Ba确凿的,人类orthologue icFSP1是特定的。测试的亚细胞定位的变化是否hFSP1 ferroptosis引起感应,gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba淘汰赛Pfa1细胞稳定overexpressing hFSP1融合到蓝色荧光蛋白(桶)。hFSP1-BFP live-cell成像信号监测的细胞co-stained Liperfluo(脂质氢过氧化物传感器)和propidium碘,只能当染细胞核质膜成为漏水的。直接与icFSP1 hFSP1-BFP-expressing细胞治疗后,固化物氧化诱导Liperfluo紧随其后,而细胞内过氧化脂质信号逐渐增加直到细胞阳性propidium碘作为衡量细胞膜破裂(无花果。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。这些结果表明,亚细胞定位的变化FSP1先于脂质过氧化和ferroptosis。gydF4y2Ba

询问是否hFSP1冷凝物可能本地化特定亚细胞的隔间,hFSP1-EGFP-Strep-expressing细胞co-stained与一些organelle-specific标记。据报道,FSP1定位不同的亚细胞结构,包括内质网(ER),高尔基体、脂滴和细胞核周围的结构gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}(扩展数据图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。然而,细胞治疗与icFSP1没有诱导hFSP1冷凝物,显然与这些亚细胞结构。此外,hFSP1冷凝物没有colocalize与其他细胞的细胞器,如核内体、溶酶体、线粒体ubiquitin-dependent aggresomes或压力颗粒(G3BP1)(扩展数据图。gydF4y2Ba4 b, cgydF4y2Ba)。icFSP1治疗后,这些冷凝物也可检测H460细胞(只表达内源性hFSP1)和细胞与更低表达水平比内生hFSP1使用doxycycline-dependent hFSP1(扩展数据图的可伸缩的表达。gydF4y2Ba4 dgydF4y2Ba)。我们进一步指出,hFSP1冷凝物动态和自由移动和融合细胞响应icFSP1治疗(无花果。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,扩展数据图。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba3gydF4y2Ba洗后),这似乎是可逆的抑制剂(无花果。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba)。更详细地探讨冷凝物的状态,我们建立了光漂白后荧光恢复(收紧)分析。这些研究显示,只有初期的冷凝物表现出收紧(无花果。gydF4y2Ba3 c, dgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),与冷凝物(扩展数据图策略,最后反而会绝处逢生。gydF4y2Ba5 a、bgydF4y2Ba和补充视频gydF4y2Ba6克ydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

这些液体droplet-like hFSP1的性质的基础上,我们认为hFSP1冷凝物可能涉及相分离。相分离是一种物理化学过程,其特征是可逆生物分子冷凝物的形成gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。这些冷凝物参与调节细胞信号后压力和与人类疾病,包括癌症和神经退行性变的gydF4y2Ba^{7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba}。特别是,相分离的分区参与目标蛋白在癌组织gydF4y2Ba^27gydF4y2Ba和促进神经退行性疾病相关蛋白质的聚集的形成gydF4y2Ba^28gydF4y2Ba。因此,我们问hFSP1是否倾向生成颗粒系统的冷凝物的。为此,hFSP1-EGFP-Strep从转染HEK293T细胞免疫沉淀反应使用Strep-tag隔离本地myristoylated hFSP1从细胞。冷凝形成化验、聚乙二醇(PEG)被用作分子拥挤代理gydF4y2Ba^{29日gydF4y2Ba}。纯化hFSP1重组与10%挂钩,因此hFSP1立即形成粘弹性材料gydF4y2Ba^30.gydF4y2Ba免疫沉淀反应相比,EGFP-Strep控制(图。gydF4y2Ba3 egydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba5 c, dgydF4y2Ba)。独自调查icFSP1是否可以启动hFSP1冷凝物,净化hFSP1与挂钩和/或icFSP1重组。然而,hFSP1形式冷凝物的存在无论icFSP1挂钩。冷凝形成这些差异可能是由于颗粒和细胞条件有很大的不同和冷凝物可以形成粘弹性物质如细胞所示。加强我们的发现hFSP1凝结在颗粒系统中通过相分离,我们使用重组hFSP1没有myristoylation (non-myr-FSP1)纯化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。再次,hFSP1可能形成冷凝FSP1和PEG浓度的方式(扩展数据图。gydF4y2Ba5种情况gydF4y2Ba)。最后,我们进行沉降分析调查是否hFSP1冷凝物引起的挂钩导致稳定的粘弹性材料。几乎所有hFSP1可以从上层的分数在球团矿的挂钩(扩展数据图。gydF4y2Ba5 i, jgydF4y2Ba),这表明hFSP1倾向形成冷凝物诱导相分离。gydF4y2Ba

相分离会导致细胞内形成membrane-less隔间,多价的交互,通常涉及内在无序区域(idr)和低区域(lcr)已知是至关重要的gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba。相分离预测gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}透露,hFSP1包含两个假定的印尼盾和一个电感电容电阻测量序列(扩展数据图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),这可能需要通过相分离冷凝形成。详细分析这些预测领域的作用,以下一系列hFSP1缺失突变体生成:∆IDR1,∆电感电容电阻测量,∆N (∆IDR1和∆LCR)和∆IDR2(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。另外两个突变体中生成膜定位受到影响gydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba}:(1)G2A突变,与强烈影响本地化myristoylation-defective突变,废除ferroptosis-suppressive FSP1的函数(ref。gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba),(2)Lyn11-G2A突变体,包含membrane-targeting Lyn11序列融合FSP1氨基端gydF4y2Ba^G2AgydF4y2Ba并能抑制ferroptosisgydF4y2Ba^{4 gydF4y2Ba}。icFSP1治疗后,只有野生型hFSP1 Lyn11-hFSP1gydF4y2Ba^G2AgydF4y2Ba改变了他们的亚细胞定位形成hFSP1冷凝物,和所有其他突变体不接受hFSP1冷凝后形成icFSP1治疗(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。符合,与myristoylation预处理细胞抑制剂imp - 1088也废除hFSP1凝结在细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)。调查是否hFSP1缺失突变体可能倾向形成冷凝物在无细胞系统中,纯化hFSP1突变体从转染HEK293T细胞重组挂钩为10%。只有野生型hFSP1和G2A Lyn11-G2A突变体形成的冷凝物的挂钩,而印尼盾和电感电容电阻测量缺失突变体没有形成冷凝物(扩展数据图。gydF4y2Ba6摄氏度gydF4y2Ba)。接下来,我们生产的重组与myristoylation hFSP1 (myr-FSP1)纯化gydF4y2BaE。gydF4y2Ba杆菌gydF4y2Ba(扩展数据图。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)来测试是否myristoylation可能负担得起钉引起的体外相分离,低盐浓度和icFSP1(扩展数据图。gydF4y2Ba6 e, fgydF4y2Ba)。挂钩和低盐浓度似乎促进相分离myristoylated hFSP1体外,而单独使用icFSP1没有诱导相分离,表明细胞上下文(其他绑定伙伴,膜环境、转录后修饰,等等)对体外分离阶段很重要。此外,相分离myristoylated hFSP1 icFSP1引起的,而non-myristoylated hFSP1gydF4y2Ba^G2AgydF4y2Ba没有形成冷凝,即使hFSP1冷凝Pfa1野生型酶存在的细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)。这些数据暗示myristoylation标记的存在促进了冷凝水的形成,为其他myristoylated蛋白质强化剂等zeste 2 (EZH2) polycomb专制复杂2亚基gydF4y2Ba^32gydF4y2Ba。此外,myristoylation可能作为贴纸提高多相链接gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}对于由icFSP1调制的相位分离,作为配体。gydF4y2Ba

调查这些突变体的潜在ferroptosis-suppressive功能,细胞使用RSL3和TAM-inducible可行性实验研究gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba击倒(扩展数据图。gydF4y2Ba6小时,我gydF4y2Ba)。这些分析证实,只有野生型hFSP1和Lyn11-hFSP1gydF4y2Ba^G2AgydF4y2Ba能有效地抑制ferroptosis。因此,这些数据表明所需的印尼盾和电感电容电阻测量可能ferroptosis-suppressive FSP1的作用,与icFSP1-induced ferroptosis触发通过hFSP1冷凝相分离。gydF4y2Ba

因为icFSP1是人类特定的酶,不抑制其鼠标(扩展数据图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),我们解决潜在的分子机制可能占这个物种特异性抑制活动(扩展数据图。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)。相分离预测gydF4y2Ba^{31日gydF4y2Ba}还透露,mFSP1港口两个预测印尼盾和一个电感电容电阻测量的N末端序列差异。因此,我们决定生成一个嵌合酶(即hmFSP1)组成的第一个27残留hFSP1(包括IDR1和LCR)熔融残留mFSP1 28 - 373。然而,hmFsp1没有形成冷凝物(扩展数据图。gydF4y2Ba7 b, cgydF4y2Ba),这意味着其他氨基酸导致敏化细胞icFSP1-mediated冷凝形成。氨基酸之间的差异的基础上,人类和老鼠orthologues,我们生成一系列的点突变在人类gydF4y2BaFSP1gydF4y2Ba并稳定表达相应的突变体在Pfa1细胞(扩展数据图。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)。这些研究让我们识别S187, L217和Q319残留物hFSP1是icFSP1-dependent冷凝水形成的关键和ferroptosis感应,替换在这些网站呈现耐药突变蛋白(无花果。gydF4y2Ba4汉英gydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba7 d, egydF4y2Ba)。考虑到(1)绑定icFSP1 FSP1并不受这些替换(扩展数据图。gydF4y2Ba7 fgydF4y2Ba)和(2)反向替换人类残留在这三个位置允许mFSP1形式icFSP1-dependent冷凝物和诱导ferroptosis(扩展数据图。gydF4y2Ba7胃肠道gydF4y2Ba)、S187 L217和Q319可能关键影响FSP1-FSP1交互触发相位分离细胞的存在icFSP1(尽管icFSP1的精确结合位点野生型hFSP1结构还有待解决)。gydF4y2Ba

评估icFSP1是否适用于体内使用,代谢稳定性和药物动力学分析,表明icFSP1老鼠明显提高微粒体稳定性和最大浓度在小鼠血浆与iFSP1(扩展数据图。gydF4y2Ba8 a、bgydF4y2Ba)。此外,评估的有效性icFSP1 tumour-bearing小鼠模型,gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba和gydF4y2BaFsp1gydF4y2Ba双基因敲除B16F10细胞overexpressing hFSP1是女性C57BL / 6 j小鼠皮下注入。后肿瘤达到大约25 - 50毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba大小,老鼠被随机分配和治疗腹腔内与车辆或icFSP1每天两次。icFSP1治疗显著地抑制肿瘤生长和减少肿瘤重量,而不影响体重(图。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)。值得注意的是,治疗tumour-bearing小鼠icFSP1显著增加了大量的hFSP1冷凝物和免疫反应性4-hydroxynonenal (4-HNE),脂质过氧化分解产品gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4 ggydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)。这些数据表明icFSP1可能引发相分离的hFSP1从而影响体内肿瘤生长。为了证实这些发现,我们建立了一个gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba和gydF4y2BaFsp1gydF4y2Badouble-knockout B16F10突变细胞系overexpressing hFSP1gydF4y2Ba^{Q319KgydF4y2Ba}研究冷凝形成体内。获得的结果与Pfa1和H460细胞,黑色素瘤细胞系依赖hFSP1gydF4y2Ba^{Q319KgydF4y2Ba}在培养细胞和体内抗icFSP1(扩展数据图。gydF4y2Ba8 e-jgydF4y2Ba);符合这一点,FSP1冷凝icFSP1治疗后没有观察到体内(无花果。gydF4y2Ba4 hgydF4y2Ba和扩展数据图。gydF4y2Ba8 hgydF4y2Ba)。调查是否icFSP1也可能工作在人类的背景下,我们使用一个人类黑色素瘤细胞系(A375)和人类肺癌细胞系(H460),来表达大量FSP1水平(ref。gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba),它可以彻底撤军后捕获代理即使生存gydF4y2BaGPX4gydF4y2Ba基因删除(即gydF4y2BaGPX4gydF4y2Ba淘汰赛)gydF4y2Ba^{3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4 gydF4y2Ba}。事实上,gydF4y2BaGPX4gydF4y2Ba淘汰赛细胞高度敏感icFSP1治疗和肿瘤生长的gydF4y2BaGPX4gydF4y2Ba淘汰赛大大抑制了细胞在相应的异种移植肿瘤模型(扩展数据图。gydF4y2Ba9 -ⅰgydF4y2Ba)。总之,我们的结果表明,hFSP1-specific抑制剂icFSP1 FSP1可能引发相分离和协同规范ferroptosis抑制剂诱导ferroptosis,作为有效的可行方法根除某些癌症的实体。gydF4y2Ba

在这里我们报道了一类yet-unrecognized vivo-efficacious hFSP1抑制剂,即3-phenylquinazolinones,表现出独特的作用机制在触发ferroptosis通过离解FSP1 FSP1膜形成的冷凝物相分离(图。gydF4y2Ba4我gydF4y2Ba)。我们的实验表明,icFSP1-mediated相分离hFSP1需要几个分子特性,如氨基端myristoylation、特定氨基酸残基(S187 L217和Q319)、印尼盾和电感电容电阻测量,导致脂质过氧化和ferroptosis GPX4-inhibited条件下。在缺乏FSP1的实验性地确定三维结构,我们绘制了氨基酸残基导致icFSP1-induced FSP1相分离,我们的突变分析的基础上,在结构预测的AlphaFold2(参考文献。gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba})。尽管球状折叠预测高信任度IDR1地区,这是标注为不确定的地区,LCR相比,预测展览一个α-helical构象中间分数。LCR的角色需要实验研究,考察该地区可能导致相分离,并可能与球状FSP1域交互。这些相互作用很可能是由icFSP1调制和有助于理解底层结构机制。此外,考虑到icFSP1发起成立FSP1冷凝物,包括等离子体membrane-localized突变体,后立即治疗和icFSP1本身不能触发凝结myristoylated FSP1体外,icFSP1可能引起冷凝物调制FSP1-membrane交互,从而减少FSP1 membrane-binding亲和力,类似于喀斯特抑制剂Cmpd2 (ref。gydF4y2Ba^37gydF4y2Ba)和其他调节器(例如,CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}对于recoveringydF4y2Ba^38gydF4y2Ba)myristoyl-ligand开关。支持我们的假设,参FSP1的三维结构模型。gydF4y2Ba^{35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba})表明,残留S187 L217和Q319都位于FSP1表面,特别是Q319接近预期的membrane-binding表面。考虑已知的指控和极地残留相关性在相分离蛋白质的相互作用gydF4y2Ba^39gydF4y2Ba,改变S187半胱氨酸,L217精氨酸和赖氨酸Q319应该增加积极的表面电荷或减少细胞极性,从而损害相分离(扩展数据图。gydF4y2Ba7我gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

配体调节的概念相分离的驱动力是称为多相链接gydF4y2Ba^{33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba}。从概念上讲,icFSP1会调节FSP1的相变,可能通过直接或间接的相互作用涉及残留物,如S187 L217 Q319,中断的交互通过诱变相界面的变化。特别是myristoylation似乎是不可缺少的在这个过程icFSP1,作为配体,优先结合myristoylated FSP1(扩展数据图的形式。gydF4y2Ba6克gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

尽管抑制FSP1本身通常是通过ferroptosis不足以驱动癌症细胞死亡gydF4y2Ba^{5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba}的一个子集癌症细胞系可以敏感的独自FSP1抑制在特定条件下,观察了ht - 1080细胞。在这方面,数据库分析可能有助于预测癌症细胞系FSP1抑制的敏感性(扩展数据图。gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。根据这一事实gydF4y2BaFsp1gydF4y2Ba基因敲除小鼠是完全可行的gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba这icFSP1不显示任何观察到的日常活动和不影响体重即使在高浓度(扩展数据无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),FSP1应当被视为一个有吸引力的目标肿瘤治疗。因此,未来的研究应适应发展中药理方法,同时目标囊肿(e) ine-GSH-GPX4节点和FSP1系统,允许有效根除癌细胞通过触发ferroptosis作为一种新的抗癌范式。gydF4y2Ba

化学物质gydF4y2Ba

Lip-1 (Selleckchem猫。不。S7699)、强力霉素(阿霉素;σ,猫。不。D9891)、RSL3(开曼群岛,猫。不。19288)、BSO(σ,猫。不。B2515)、iFSP1 (ChemDiv,猫。 no. 8009-2626), icFSP1 (ChemDiv, cat. no. L892-0224 or custom synthesis by Intonation Research Laboratories), erastin (Merck, cat. no. 329600), ML210 (Cayman, cat. no. Cay23282-1), FIN56 (Cayman, cat. no. Cay25180-5), FINO2 (Cayman, cat. no. Cay25096-1), deferoxamine mesylate salt (DFO; Sigma, cat. no. 138-14-7), ferrostatin-1 (Fer-1; Sigma, cat. no. SML0583), zVAD-FMK (zVAD; Enzo Life Sciences, cat. no. ALX-260-02), necrostatin-1s (Nec-1s; Enzo Life Sciences, cat. no. BV-2263-5), MCC950 (Sigma, cat. no. 5381200001), olaparib (Selleckchem, cat. no. S1060), staurosporine (STS; Cayman, cat. no. 81590), recombinant human tumour necrosis factor (TNF; R&D Systems, cat. no. NBP2-35076), Smac mimic (BV-6; Selleckchem, cat. no. S7597), nigericin (Thermo Fisher, cat. no. N1495), IMP-1088 (Cayman, cat. no. Cay25366-1) and lipopolysaccharide (LPS; Sigma, cat. no. L2880) were used in this study.

老鼠gydF4y2Ba

五到六个女性C57BL / 6 j和无胸腺的裸小鼠获得从查尔斯河,和6 - 7-week-old老鼠用于实验。所有的老鼠都保持在标准条件下与水和食物提供的随意和控制环境(22±2°C,湿度55%±5%,12 h光/ 12 h黑暗周期)的亥姆霍兹慕尼黑SPF-IVC标准条件下动物设施。符合德国的所有实验动物福利法律和制度委员会批准在动物实验上巴伐利亚政府(rob - 55.2 - 2532. - vet_02 - 17 - 167)。gydF4y2Ba

细胞系gydF4y2Ba

TAM-induciblegydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba基因敲除小鼠不灭的成纤维细胞(称为Pfa1细胞)之前被报道gydF4y2Ba^18gydF4y2Ba。基因组gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba删除可以通过TAM-inducible使用克里尔Cre重组酶的激活gydF4y2Ba^T2gydF4y2Ba/gydF4y2BaloxPgydF4y2Ba系统。ht - 1080、786 - o, A375 NCI-H460 (H460), mda - mb - 436, HT-29 B16F10、4 t1细胞从写明ATCC购买。从DSMZ THP-1细胞获得)。人类PBMC细胞从Tebu-bio购买(猫。不。088 ser-pbmc-f)。SUDHL5、SUDHL6 DOHH2并从美国Hailfinger OCI-Ly19细胞是一个礼物。Rat1细胞的礼物Medizinische Hochschule汉诺威。Pfa1, ht - 1080, 786 - o, A375, HT-29, Rat1 B16F10细胞培养在high-glucose DMEM (4.5 g lgydF4y2Ba^1gydF4y2Ba与10%葡萄糖)的边后卫,2毫米gydF4y2BalgydF4y2Bapenicillin-streptomycin谷氨酰胺和1%。H460, mda - mb - 436、THP-1 PBMC, SUDHL5 SUDHL6 DOHH2和4 t1细胞培养在RPMI GlutaMax penicillin-streptomycin的边后卫为10%和1%。OCI-Ly19细胞培养在IMDM penicillin-streptomycin的边后卫为10%和1%。生成稳定的超表达细胞系,适当的抗生素(1µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba嘌呤霉素,10µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba杀稻瘟菌素和0.5毫升-1.0毫克gydF4y2Ba^1gydF4y2BaG418)。gydF4y2BaGPX4gydF4y2Ba敲除人类A375 H460细胞培养在1µM Lip-1维护。所有细胞培养在37°C公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和验证为支原体是负的。gydF4y2Ba

细胞生存能力分析gydF4y2Ba

细胞被播种在96孔板和培养过夜。所有每个细胞株细胞数量条件中描述的补充表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。第二天,介质改为介质含有以下成分:RSL3, ML210, erastin, FIN56, FINO2, BSO, iFSP1, icFSP1, Lip-1,柴油,Fer-1, zVAD, Nec-1s, MCC950, olaparib, STS, TNF, Smac模仿或nigericin浓度表示。TAM和强力霉素治疗,细胞与化合物同时被播种。细胞生存能力是决定1 h (nigericin), 24 - 48小时之内(RSL3、ML210 erastin, FIN56, FINO2, iFSP1, icFSP1, STS, TNF, Smac模仿和zVAD)或72 h (BSO、icFSP1 TAM和强力霉素)治疗开始后使用AquaBluer(多目标制药、猫。不。6015)作为可行的细胞的指标根据制造商的协议。细胞凋亡的诱导,ht - 1080细胞与不同浓度的STS孵化24 h。necroptosis感应,HT-29细胞与不同浓度的孵化TNF Smac模仿(400海里)和zVAD(30µM) 24 h。pyroptosis感应,THP-1细胞刺激有限合伙人(1µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba,2 h)孵化nigericin 1 h。ferroptosis感应,细胞被孵化ferroptosis诱导24 - 72 h。gydF4y2Ba

读出,荧光测定的激发/发射波长的540/590 nm使用SpectraMax M5标与SoftMax Pro v。7(分子设备)与AquaBluer 4 h孵化后在正常细胞培养条件。相对细胞生存能力(%)计算如下:(荧光样品-背景)/(适当的控制样本的荧光背景)×100。gydF4y2Ba

LDH释放化验gydF4y2Ba

细胞被播种在96孔板和培养过夜。第二天,介质改为介质含有化合物和细胞培养另一个24小时。细胞死亡率是衡量使用细胞毒性检测设备(LDH)(罗氏,猫。不。11644793001)原则上遵循制造商的协议。总之,细胞培养上清液收集样本作为媒介。细胞然后用PBS细胞溶解含0.1% Triton x - 100作为溶解产物样本。媒介和溶菌产物样本分别对微型板块与试剂混合,和吸光度测量492海里使用SpectraMax M5标孵化后在室温下15 - 30分钟。细胞死亡比例计算了LDH释放(%)如下:(介质样品的吸光度-背景)/((溶菌产物样品的吸光度-背景)+(介质样品的吸光度-背景))×100。gydF4y2Ba

FSP1抑制剂的筛选gydF4y2Ba

野生型和gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba淘汰赛Pfa1细胞稳定overexpressing hFSP1被播种在不同的384孔板(500细胞/)和筛选小分子抑制剂化合物库的报道gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。不同的细胞系的细胞生存能力评估使用AquaBluer 48 h后治疗的开始。化合物表现出选择性杀伤力gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba淘汰赛Pfa1细胞稳定overexpressing hFSP1被验证在细胞生存能力分析和体外FSP1酶化验。gydF4y2Ba

脂质过氧化作用分析gydF4y2Ba

脂质过氧化反应化验,每口井的100000个细胞被播种在12-well板实验前1天。第二天,细胞治疗2.5µM icFSP1 3 h,然后孵化1.5µM C11-BODIPY 581/591(表达载体,猫。不。D3861) 5%的30分钟的有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba气氛在37°C。随后,细胞与PBS洗一次,使胰蛋白酶化,然后在500年resuspendedµl PBS。40-μm细胞细胞通过过滤器和分析流式细胞分析仪(CytoFLEX,贝克曼库尔特)与488 nm激光激发。从FITC检测器收集的数据(氧化形式的BODIPY) 525/40-nm带通滤波器和PE检测器(BODIPY简化型的),585/42-nm带通滤波器使用CytExpert v.2.4(贝克曼库尔特)。至少每样10000事件进行分析。数据分析使用FlowJo软件(FlowJo)。荧光C11-BODIPY 581/591的比率(脂质过氧化作用)(FITC /聚乙烯比(氧化/减少比率))计算如下gydF4y2Ba^12gydF4y2Ba(中位数FITC-A荧光- FITC-A荧光清白的样本中位数)/(平均PE-A荧光- PE-A荧光清白的样本中位数)。补充图所示控制策略是一个例子。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

Oxilipidomics分析gydF4y2Ba

二百万个细胞被播种在实验前1天15厘米盘子。第二天,细胞治疗5µM icFSP1诱导脂质过氧化反应。五小时后,收集细胞,采样液氮和储存在-80°C。使用甲基-脂质从细胞中提取gydF4y2Ba叔gydF4y2Ba丁基醚(MTBE)的方法gydF4y2Ba^40gydF4y2Ba。总之,细胞颗粒在PBS收集包含dibutylhydroxytoluene(二叔丁基对甲酚;100µM)和二乙撑三胺pentaacetate(二乙三胺五醋酸;100µM)清洗和离心机。飞溅LIPIDOMIX(两代情极性脂质)添加(2.5µl),和样本在冰上孵化15分钟。在冰冷的甲醇(375µl)和MTBE(1250µl),样本涡和孵化1 h在4°C(轨道振动器,32 rpm)。相分离被加水(375µl),诱导和样本漩涡,孵化10分钟在4°C(轨道振动器,32 rpm)和离心分离有机和水阶段(10分钟,4°C, 1500gydF4y2BaggydF4y2Ba)。有机相收集,干在真空蒸发器,并在100年重新溶解µl异丙醇。脂质分析提取被转移到玻璃小瓶。gydF4y2Ba

反相LC进行了在日本岛津公司ExionLC配有Accucore C30列(150×2.1毫米,2.6µm, 150;热费希尔科学)。脂质分离,梯度洗脱溶剂(1:1 (v / v)乙腈/水)和溶剂B (85:15:5 (v / v / v)异丙醇/乙腈/水),包含5毫米NH两种gydF4y2Ba_{4 gydF4y2Ba}HCOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和0.1% (v / v)甲酸。分离了50°C流量为0.3毫升分钟gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba使用下面的梯度:0-20分钟,从10%增加到86% B(曲线4);20 - 22分钟,从86%提高到95% B(5)曲线;22日至26日进行的最小值,95%权力平等主义的;26 - 26.1分钟,从95%减少到10% B(曲线5),这是紧随其后的是re-equilibration 5分钟10% BgydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba。MS分析Sciex 7500系统配备一个电喷雾电离(ESI)源和在负离子模式下操作。产品在MRM模式进行分析监控由父离子转移到女儿离子,如补充表所述gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,以下参数:TEM, 500°C;GS1, 40;GS2, 70;坏蛋,40;CAD、9;−3000 V。gydF4y2Ba

曲线下的面积为父的女儿离子转变被适当的集成和标准化的脂质物种,PC (15:0/18:1 (d7))或PE (15:0/18:1 (d7)),从飞溅LIPIDOMIX质量规范标准(两代情极性脂质)。归一化峰地区进一步日志转换和auto-scaled MetaboAnalyst v.5.0在线平台(gydF4y2Bahttps://www.metaboanalyst.cagydF4y2Ba)gydF4y2Ba^41gydF4y2Ba。零值取而代之的是最小值的0.2倍的样品中发现对于一个给定的氧化脂质。氧化脂质表现出显著差异(方差分析,调整gydF4y2BaPgydF4y2Ba值(错误发现率(罗斯福))截止0.05)的样本用于热之间的地图。热GraphPad棱镜9中创建地图。颜色方案对应于auto-scaled对数转换褶皱变化相对于均值日志值样本。gydF4y2Ba

细胞溶菌作用和免疫印迹gydF4y2Ba

细胞细胞溶解在LCW裂解缓冲(0.5% Triton x - 100, 0.5%钠脱氧胆酸盐盐,150毫米氯化钠,Tris-HCl 20毫米,10毫米EDTA和30毫米焦磷酸钠四元十水合物)补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(完整和phoSTOP;罗氏,猫。04693116001和04693116001号)和离心机20000gydF4y2BaggydF4y2Ba1 h在4°C。上层清液是通过增加采样6×SDS样品缓冲(375毫米Tris-HCl pH值6.8,9% SDS、50%甘油、9%β-mercaptoethanol和0.03%溴酚蓝)。在98°C加热后(xCT 55°C) 3分钟,样本决定12% sds - page凝胶(Bio-Rad,猫。不。4568043或4568043),随后electroblotted到PVDF膜(Bio-Rad,猫。不。170 - 4156)。膜被封锁的5%脱脂牛奶(罗斯,猫。不。Tris-HCl T145.2) TBS-T(20毫米,150毫米Tween-20氯化钠和0.1%)然后探测主要抗体,稀释第一抗体稀释缓冲(TBS-T南BSA为5%和0.1%gydF4y2Ba_3gydF4y2Ba(σ,猫。不。针对GPX4 S2002)), (1:1,000;Abcam,猫。不。ab125066), valosin-containing蛋白质(VCP;1:1,0000;Abcam,猫。不。ab11433或ab109240),国旗标签(1:5,000; Cell Signaling Technology, cat. no. 2368), HA tag (1:1,000; clone 3F10, homemade), hFSP1 (1:1,000; Santa Cruz, cat. no. sc-377120, AMID), mFSP1 (1:500; clone AIFM2 1A1, rat IgG2a), hFSP1 (1:10; clone 6D8, rat IgG2a), mFSP1 (1:5; clone AIFM2 14D7, rat IgG2b), human SLC7A11 (1:10; rat IgG2a monoclonal antibody against an N-terminal peptide of human xCT, clone 3A12-1-1, developed in house), mouse SLC7A11 (1:1,000; Cell Signaling Technology, cat. no. 98051), ACSL4 (1:1,000; clone A-5, Santa Cruz, cat. no. sc-271800) or β-actin-HRP (1:50,000; Sigma, cat. no. A3854) diluted in 5% skim milk in TBS-T overnight. After membranes were washed and probed with appropriate secondary antibodies diluted in 5% skim milk in TBS-T, antibody–antigen complexes were detected with the ChemiDoc Imaging System with Image Lab v.6.0 (Bio-Rad). Representative images are shown after adjustment to the appropriate brightness and angle using ImageJ/Fiji software (v.1.52 and v.1.53).

表达和sgRNA质粒结构gydF4y2Ba

本研究构建的所有质粒使用标准的分子生物学技术和验证了排序如下。一个人的gydF4y2BaFSP1gydF4y2Ba互补脱氧核糖核酸(gydF4y2BaNM_001198696.2gydF4y2Ba1008:C > T)从之前报道克隆向量gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。Codon-optimized序列gydF4y2Ba亩骶gydF4y2Ba(鼠标)FSP1 (gydF4y2BaNP_001034283.1gydF4y2Ba),gydF4y2Ba鼠形gydF4y2Ba(鼠)FSP1 (gydF4y2BaNP_001132955.1gydF4y2Ba),gydF4y2Ba背带吊裤带gydF4y2Ba(鸡)FSP1 (gydF4y2BaXP_421597.1gydF4y2Ba),gydF4y2Ba非洲爪蟾蜍光滑的gydF4y2Ba(青蛙)FSP1 (gydF4y2BaNP_001091397.1gydF4y2Ba)被克隆到p442向量。Codon-optimized序列对人类gydF4y2BaFSP1gydF4y2Ba(gydF4y2BaNP_001185625.1gydF4y2Ba)和鼠标gydF4y2BaFsp1gydF4y2Ba(gydF4y2BaNP_001034283.1gydF4y2Ba)被捻合成生物科学和subcloned 141 - ires -普罗向量。生成缺失突变体或执行subcloning,所需的DNA序列首先用KOD放大一个PCR反应混合液(σ,猫。不。kmm - 201 - nv)或PrimeSTAR马克斯DNA聚合酶(豆类生物,猫主人组合。不。R045A)和PCR结果产品被向导SV Gel&PCR清理净化系统(Promega,猫。不。A9285)根据制造商的协议。结扎的PCR反应产品或单导RNA (sgRNA)工器消化向量进行使用T4连接酶(内,猫。不。 M0202L) or In-Fusion cloning enzymes (Takara Bio, cat. no. 639649 or 638948) according to the manufacturer’s protocol. Subsequently, reaction mixtures were transformed into stable competent cells (NEB, cat. no. C3040H). Plasmids were isolated using the QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, cat. no. 27106) according to the manufacturer’s protocol; the correct inserts of plasmids were confirmed by sequencing.

慢病毒生产和转导gydF4y2Ba

HEK293T细胞被用来产生慢病毒颗粒。同向性包膜蛋白的小鼠白血病病毒(MLV)是用于mouse-derived细胞,而amphitropic包膜蛋白VSV-G用于来自人体的细胞。第三代慢病毒包装系统组成的转移质粒,信封质粒(pEcoEnv-IRES-puro或pHCMV-EcoEnv(同向性颗粒)或pMD2。G(泛嗜性粒子))和包装质粒(pMDLg_pRRE和pRSV_Rev或psPAX2)是co-lipofected HEK293T细胞使用转染试剂(裴MAX (Polysciences,猫。不。24765)或X-tremeGENE惠普试剂(罗氏,猫。不。06366236001))。病毒particle-containing细胞培养上清液收集后48 - 72 h转染,透过0.45 -µm PVDF过滤器(微孔,猫。不。 SLHV033RS) and then used for lentiviral transduction.

细胞被播种在12 -或6-well盘子中补充µg 10毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba硫酸鱼精蛋白和慢病毒与细胞孵化过夜。第二天,细胞培养基代替新鲜培养基含有适当的抗生素,如嘌呤霉素(Gibco,猫。不。A11138-03;1µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba),杀稻瘟菌素(表达载体,猫。不。A1113903;µg 10毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)或G418(表达载体,猫。不。10131 - 035;1毫克毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba))和细胞培养,直到non-transduced细胞死亡。gydF4y2Ba

CRISPR-Cas9-mediated基因敲除gydF4y2Ba

sgRNAs设计目标关键基因的外显子的兴趣,和基因敲除证实了西方墨点法。sgRNAs被克隆到BsmBI-digested lentiCRISPRv2-blast, lentiCRISPRv2-puro lentiGuide-neo向量(Addgene,猫。号。98293年、98290年和139449年)。所有序列sgRNAs补充表中列出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

生成淘汰赛细胞mda - mb - 436, 786 - o, A375, H460 B16F10和4 t1细胞与所需的瞬变co-transfected sgRNAs表示从lentiCRISPRv2-blast lentiCRISPRv2-puro使用X-tremeGENE惠普试剂如前所述gydF4y2Ba^{6克ydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba}。转染后的一天,选择开始与嘌呤霉素(1µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)和杀稻瘟菌素(µg 10毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)。选择2 - 3天后,单细胞克隆分离,分离克隆免疫印迹和测序的基因组DNA进行验证。gydF4y2Ba

从pCW-Cas9-blast生成Dox-inducible淘汰赛细胞,慢病毒(Addgene,猫。不。83481)传导到ht - 1080细胞随后选择和建立单细胞克隆如前所述gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba。慢病毒产生lentiGuide-neo向量窝藏sgRNAs针对FSP1转导pCW-Cas9-blast ht - 1080细胞,其次是选择用G418如上所述。阿霉素诱导后,失去FSP1表达证实了免疫印迹。gydF4y2Ba

生成Dox-inducible FSP1-EGFP-expressing细胞,H460gydF4y2BaFSP1gydF4y2Ba淘汰赛细胞转导与慢病毒(pCW-FSP1gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba-EGFP-blast或pCW-FSP1gydF4y2Ba^{Q319KgydF4y2Ba}-EGFP-blast)。阿霉素治疗后的细胞,可伸缩FSP1表达证实了免疫印迹。gydF4y2Ba

稳定表达的转染gydF4y2Ba

Gpx4gydF4y2Ba淘汰赛4 t1细胞gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba和gydF4y2BaFsp1gydF4y2Badouble-knockout B16F10细胞转染141 - ires雪茄烟,141 - hfsp1gydF4y2Ba^WTgydF4y2Ba或hFSP1gydF4y2Ba^{Q319KgydF4y2Ba}-IRES-puro和141 - mfsp1 ires -普罗向量使用X-tremeGENE惠普试剂。转染后的一天,选择开始与嘌呤霉素(1µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba)和Lip-1被撤的媒介选择细胞稳定FSP1表达式。获得细胞稳定表达,细胞保持选择的条件下。gydF4y2Ba

生产和净化FSP1酶gydF4y2Ba

hFSP1重组蛋白(non-myr-FSP1)在BL21产生gydF4y2BaE。gydF4y2Ba杆菌gydF4y2Ba和亲和色谱法纯化Ni-NTA系统如前所述gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

蛋白质由下拉隔离,HEK293T细胞被播种在10或15厘米菜肴和转染构造编码EGFP-Strep-tagged蛋白质。与PBS洗涤后,细胞细胞溶解在LCW裂解缓冲补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒和1毫米二硫苏糖醇(德勤)。收集细胞提取物和细胞刮刀离心机,享年20000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba1 h在4°C。上层清液与MagStrep孵化type3 XT珠子(Biozol,猫。不。2-4090-002)在4°C 1 - 2 h。珠子被洗两次洗涤缓冲(Tris-HCl 100毫米,150毫米氯化钠和1毫米EDTA)。EGFP-Strep-tagged蛋白质与洗脱筛选了缓冲区(Tris-HCl 100毫米,150毫米氯化钠,1毫米EDTA和50毫米生物素),其次是稀释3µM TBS Tris-HCl(50毫米和150毫米氯化钠)。蛋白质浓度估计从280 nm的吸光度测量UV5Nano分光光度计(梅特勒-托利多)。系数计算通过使用ExPASy ProtParam (gydF4y2Bahttps://web.expasy.org/protparam/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Myristoylated coexpressing获得的蛋白质gydF4y2BaNgydF4y2Ba与FSP1 -myristoyltransferase 1 (hsNMT1)。gydF4y2BaE。gydF4y2Ba杆菌gydF4y2BaBL21细胞转化与构造编码hsNMT1 (petCDF向量,壮观霉素耐药性)和FSP1 (FSP1-EGFP c端gydF4y2Ba_6克ydF4y2Ba卡那霉素抗性标记,petM13)。净化了至于野生型FSP1与凝胶过滤色谱法的最后一步。纯化蛋白得到和证实了变性SDS凝胶。确认myristoylated蛋白质的存在得到了女士。gydF4y2Ba

质谱分析gydF4y2Ba

证实了Myristoylation LC-ESI-MS Synapt XS(水域)。蛋白质分离的Acquity UPLC蛋白质本·C4列(0.4毫升分钟gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba;缓冲,0.1%的甲酸水;缓冲B,在乙腈0.1%甲酸)和数据分析使用Masslynx v.4.2(水域)。gydF4y2Ba

FSP1酶活性和抑制化验gydF4y2Ba

刃天青化验,酶反应是准备在TBS Tris-HCl(50毫米和150毫米氯化钠)包含50 nM non-myr-FSP1 200μM NADH和抑制剂(iFSP1或icFSP1)。在100年添加μM刃天青钠盐(σ,猫。不。R7017),荧光强度(gydF4y2BaFgydF4y2Ba;激发/发射波长的540/590 nm)测量每1分钟使用SpectraMax iD5标与SoftMax Pro v。7(分子设备)在37°C。反应和DMSO溶液的体积相同没有刃天青被用来计算ICgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值。曲线拟合和计算的集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值进行了使用GraphPad棱镜9。gydF4y2Ba

NADH消费分析、酶反应是准备在PBS (Gibco,猫。不。14190094)包含25 nM non-myr-FSP1 200μM甲萘醌(σ,猫。不。M5625)或200µM公鸡gydF4y2Ba_0gydF4y2Ba(σ,猫。不。D9150)和抑制剂(iFSP1或icFSP1)。200μM NADH、后吸光度在340 nm 37°C测量每30年代使用SpectraMax M5标(分子设备)。反应没有NADH和没有酶被用来标准化结果。曲线拟合进行了使用GraphPad棱镜9。gydF4y2Ba

体外FSP1凝结化验gydF4y2Ba

纯化EGFP-Strep或hFSP1-EGFP-Strep标记蛋白质稀释与1毫米德勤TBS补充。蛋白质纯化Strep-tagged然后混合挂钩3350(σ,猫。不。P3640)和/或icFSP1;最终浓度的蛋白质,挂钩和icFSP1表示在每个图的传说。共焦显微镜分析,样本立即转移到客观幻灯片和EGFP信号快速捕获与禅宗黑软件使用LSM880显微镜(v.2.3 ZWISS)×63水浸的目标。共焦显微镜分析、重组c端GFP-tagged FSP1和myr-FSP1以15μM蛋白质浓度在PBS (pH值7.4;300毫米氯化钠)或者10μM蛋白质浓度在PBS (pH值7.4;150毫米氯化钠)。在255°C共焦荧光显微镜进行莱卡TCS SP8共焦显微镜使用×63水浸的目标。 Samples were excited with a 488-nm laser (GFP) and imaged at 498–545 nm.

测量浊度,不同浓度的non-myr-FSP1和挂钩在10µl重组在384孔板和吸光度在600纳米测量使用SpectraMax iD5标(分子设备)。显示PCR non-myr-FSP1冷凝管,图片是使用智能手机。代表具有亮non-myr-FSP1冷凝客观幻灯片上的图片是使用Eclipse Ts2显微镜捕捉到一个(尼康)×40目的。gydF4y2Ba

对沉降分析,重组non-myr-FSP1是混合了相同数量的TBS 0%或20% PEG和1毫米德勤样本离心机,享年2500岁gydF4y2BaggydF4y2Ba为5分钟。上层清液收集在一个新管,1毫米的颗粒在TBS resuspended补充德勤。上层清液和resuspended non-myr-FSP1收集通过添加6×SDS样品缓冲,随后通过SDS - page来解决。一个凝胶受到西方墨点法和探测anti-FSP1 (1:1,000;圣克鲁斯,猫。不。在sc - 377120)。另一凝胶是立即沾Coomassie染色溶液毫升(1毫克gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba考马斯亮蓝g - 250(σ,猫。不。1154440025),50%甲醇和10%乙酸)15分钟,然后浸泡在洗涤缓冲乙酸甲醇(70%和7%)。洗涤缓冲使用微波炉加热,缓冲了直到蛋白质乐队给了明确的信号。gydF4y2Ba

体外饱和转移实验的区别gydF4y2Ba

实验进行饱和转移区别力量皇冠三世高清光谱仪在600 - mhzgydF4y2Ba^1gydF4y2BaH频率使用H / N / C triple-resonance低温探头。光谱被记录在10°C和5µM重组hFSP1(突变)和100倍摩尔过剩的icFSP1 PBS包含150毫米氯化钠,1% (v / v) DMSO-d6和10% (v / v) DgydF4y2Ba_2gydF4y2Badeuterium-lock O。饱和时间是2.5秒,开关频率0.68和−17 ppm,分别。核磁共振光谱处理使用上旋4.0.6(力量)。gydF4y2Ba

免疫细胞化学gydF4y2Ba

共焦显微镜图像都是获得使用LSM880显微镜(蔡司)×63目标和相应的适当的滤波器组与禅宗的蓝色荧光团和分析软件(v.3.2 ZWISS)或ImageJ /斐济除非另外注明。细胞被播种µ-Slide 8-well幻灯片(Ibidi猫。不。80826)1天前的实验。第二天,媒介改变了新鲜细胞培养基补充2.5µM icFSP1。孵化后表明,细胞被固定和染色根据下列程序:4%多聚甲醛固定5 - 10分钟;透化作用,阻止了15分钟0.3% Triton x - 100和10毫克毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba在PBS BSA;在一夜之间4°C和孵化主要抗体或稀释浮层anti-AIFM2 (FSP1;克隆14 d7,自制)。抗体稀释如下:1:10 anti-YPYDVPDYA-tag (HA;克隆3 f10)和1:10 0 anti-calnexin (Abcam,猫。不。ab22595)、anti-GM130(克隆EP892Y Abcam,猫。不。ab52649)、anti-EEA1 (C45B10克隆,细胞信号技术,猫。不。 3288) and anti-LAMP1 (clone H4A3, Santa Cruz, cat. no. sc-20011)) in primary antibody dilution buffer. Cells were further stained with appropriate fluorophore-conjugated secondary antibodies (1:500 dilution) and DAPI (1:10,000 dilution) in TBS-T or PBS for 1–2 h at room temperature, avoiding light. Finally, all samples were mounted in Aqua-/PolyMount (Polysciences, cat. no. 18606-20) and dried at 4 °C overnight. Staining of mitochondria, lipid droplets and aggresomes was performed using MitoTracker Red CMXRos (20 nM; Invitrogen, cat. no. M7512), LipidSpot 610 (1:1,000; Biotium, cat. no. 70069-T) and the Proteostat detection kit (1:10,000; Enzo, cat. no. ENZ-51035-0025), respectively, according to the manufacturer’s protocol.

收紧gydF4y2Ba

Pfa1细胞(20000)被播种在µ-Slide VI 0.4幻灯片(Ibidi,猫。不。80606)1天前的实验。第二天,介质改为high-glucose DMEM补充10%的边后卫,2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺,penicillin-streptomycin 1%, 2.5µM icFSP1玫瑰和10毫米。与icFSP1孵化后的2 - 4 h, 2 - 5矩形区域,每个包含三个多FSP1冷凝物被选为漂白的地区。漂白前一图像获得被认为对应时间' 0 '。随后,所选地区photobleached使用的最大激光强度和收紧监测至少间隔(~ 5 s)使用一个LSM880显微镜(蔡司)。gydF4y2Ba

量化收紧利率,感兴趣的区域(ROI)对于每个冷凝物(gydF4y2Ba我gydF4y2Baphotobleached地区)和一个冷凝物(gydF4y2BacgydF4y2Ba)在non-photobleached区域确定使用ImageJ /斐济和凝析油的平均荧光强度gydF4y2Ba我gydF4y2Ba在时间gydF4y2BatgydF4y2Ba,gydF4y2BaFgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)。在确定每一次的荧光值,gydF4y2BaFgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba是归一化的值gydF4y2BaFgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(0)获得的相对荧光(RFgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba每个漂白冷凝面积的)。在观察和反映淬火效果光漂白,每个射频gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)值是由相对荧光值归一化时间gydF4y2BatgydF4y2Ba冷凝液(gydF4y2BacgydF4y2Ba(RF) non-bleached冷凝区域gydF4y2Ba_cgydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)如下:gydF4y2BaFgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)=射频gydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)/射频gydF4y2Ba_cgydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)= (gydF4y2BaFgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)/gydF4y2BaFgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(0))/ (gydF4y2BaFgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)/gydF4y2BaFgydF4y2Ba_cgydF4y2Ba(0))。最后,收紧利率(%)在时间gydF4y2BatgydF4y2Ba在计算粒子的均值gydF4y2BaFgydF4y2Ba_我gydF4y2Ba(gydF4y2BatgydF4y2Ba)×100如前所述gydF4y2Ba^21gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

Live-cell成像gydF4y2Ba

co-staining或冲刷分析,Pfa1细胞细胞(15000 - 30000)被播种µ-Dish 35毫米低菜(Ibidi,猫。不。80136)和孵化过夜。第二天,细胞培养基改为FluoroBrite DMEM (Gibco,猫。不。A1896701)补充10%的边后卫,2毫米gydF4y2BalgydF4y2Bapenicillin-streptomycin谷氨酰胺和1%。Live-cell显微镜使用3 d细胞Explorer执行(Nanolive)前夕v.1.8.2软件和相应的适当的滤波器组。在成像过程中,细胞维持在37°C和5%的公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用一个温控孵化室。co-staining分析,细胞进行1 h和5µM Liperfluo (Dojindo,猫。不。L248-10),然后改为FluoroBrite DMEM包含0.2µg毫升gydF4y2Ba^1gydF4y2Bapropidium碘(σ,猫。不。开始使用Nanolive P4170)和收购。记录一个图像后,1毫米的icFSP1 FluoroBrite DMEM被加入到菜肴(最终的浓度10µM)同时继续记录图像。图像获得每10分钟以上4 h, GFP,桶和RFP过滤集被用来获取信号。冲刷实验,high-glucose DMEM改为FluoroBrite DMEM之前实验数据采集使用Nanolive紧随其后。记录一些图片后,0.25毫米的icFSP1 FluoroBrite DMEM被加入到菜肴(最终的浓度2.5µM)和记录图像持续了4小时。此后,新鲜的菜是经过仔细洗一次FluoroBrite DMEM没有icFSP1和填充介质。图像采集是立即重新启动。图像记录每5分钟一个小时; that is, the total duration of data acquisition was around 5 h.

确定冷凝物在细胞的数量,Pfa1细胞细胞(15000 - 20000)被播种µ-Slide 8-well幻灯片(Ibidi,猫。不。80826)和孵化过夜。第二天,介质改为high-glucose DMEM补充10%的边后卫,2毫米gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺,penicillin-streptomycin 1%, 2.5µM icFSP1和赫斯特。立即之后,重点是调整和赫斯特和EGFP图像记录使用Axio观察者Z1成像系统与VisView v.4.0 (Visitron系统ZWISS)×20空中目标和CCD相机(CoolSnap ES2光度)与相应的滤波器组。在成像过程中,细胞维持在37°C和5%的公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba使用一个温控孵化室。成像软件ImageJ /斐济用于可视化和CellProfiler (v.4.1.3 Broad研究所)被用来计算每个单元中的冷凝物。gydF4y2Ba

皮下肿瘤模型gydF4y2Ba

所有老鼠都来自查尔斯河。为同源的皮下肿瘤实验,gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba和gydF4y2BaFsp1gydF4y2Badouble-knockout B16F10细胞稳定overexpressing hFSP1-HA (1×10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba细胞在100年µl PBS)皮下注入的右翼7-week-old女C57BL / 6 j小鼠。后肿瘤达到大约25 - 50毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba的大小、小鼠被随机分配和处理车辆或icFSP1(50毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba每天两次,语调)腹腔内注射4 - 5天。生成肿瘤样本染色,gydF4y2BaGpx4gydF4y2Ba和gydF4y2BaFsp1gydF4y2Badouble-knockout B16F10细胞稳定表达hFSP1gydF4y2Ba^WTgydF4y2Baha或hFSP1gydF4y2Ba^{Q319KgydF4y2Ba}公顷(1×10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba细胞在100年µl PBS)皮下注入的右翼7-week-old女C57BL / 6 j小鼠。后肿瘤达到大约25毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba的大小、小鼠被随机分配和处理车辆或icFSP1(50毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba每天,语调)腹腔内注射两次。gydF4y2Ba

异种移植的皮下肿瘤实验,gydF4y2BaGPX4gydF4y2Ba淘汰赛A375细胞(5×10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba细胞在100年µl PBS)皮下注入7-week-old女无胸腺的裸体小鼠的右翼。后肿瘤达到大约25 - 100毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba的大小、小鼠被随机分配和处理车辆或icFSP1(50毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba每天两次,语调)腹腔内注射第一之后4天,每天一次。gydF4y2Ba

异种移植的皮下肿瘤实验,gydF4y2BaGPX4gydF4y2Ba淘汰赛H460细胞(5×10gydF4y2Ba^6克ydF4y2Ba细胞在100年µl PBS)皮下注入流行女无胸腺的裸体小鼠的右翼。后肿瘤达到约100毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba的大小、小鼠被随机分配和处理车辆或icFSP1(50毫克公斤gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba每天,语调)腹腔内注射两次。gydF4y2Ba

icFSP1溶解在45% PEG E 300(σ,猫。不。91462 - 1 - PBS公斤)和55% (Gibco,猫。不。14190094)。肿瘤是由卡尺测量每一天,和肿瘤体积计算使用以下公式:肿瘤体积=长×宽gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba×0.52。当肿瘤大于1000毫米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba在尺寸测量或肿瘤坏死,肿瘤被认为达到了人道的端点。当肿瘤到达人道的端点,实验是停了下来,没有进一步的研究。gydF4y2Ba

肿瘤组织染色gydF4y2Ba

解剖组织固定在4%多聚甲醛在PBS一夜之间在4°C。组织免疫荧光染色,固定在20%蔗糖在PBS孵化一夜之间在4°C,紧随其后的是嵌入在10月越来越多的化合物(TissueTek,樱花)干冰和存储在-80°C。冷冻组织被切成5-µm-thick部分使用低温恒温器Microm HM 560(热费希尔科学)在-30°C。组织部分后缀有1%多聚甲醛在PBS 10分钟,随后固定用67%的乙醇和33%醋酸10分钟。部分与屏蔽解决方案孵化山羊血清(5%和0.3% Triton x - 100在PBS) 30分钟然后孵化主要抗体(anti-HA(克隆、3 f10;1:10;开发的房子),anti-4-HNE (JaICA,猫。不。HNEJ-2;1:50)和anti-AIFM2 (FSP1克隆14 d7; undiluted; developed in house)) diluted in blocking solution overnight at 4 °C. The next day, sections were incubated with appropriate fluorophore-conjugated secondary antibodies (goat anti-rat Alexa Fluor 488 IgG (H+L) (1:500; A-11006, Invitrogen), goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor 647 (1:500; ab150115, Abcam) and donkey anti-rat IgG Alexa Fluor 555 (1:500; ab150154, Abcam)) in secondary dilution buffer (1% BSA and 0.3% Triton X-100 in PBS) for 2 h at room temperature. DNA was visualized with DAPI staining for 5 min, and slides were mounted in Aqua-/PolyMount. Images were obtained using an LSM880 microscope (Zeiss) and analysed with Zen Blue or ImageJ/Fiji software.

药物动力学和代谢稳定性分析gydF4y2Ba

所有的研究都是由Bienta /烯胺有限公司gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

显示所有数据均值±s.e.m。或者意味着南达科他州±。,和thenumber (ngydF4y2Ba)在每个图传奇生物或技术复制指定代表。所有实验(除另有描述传说)独立进行至少两次。至少对老鼠的实验中,三个动物包括每组一次或两次。双尾学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba测试和单向或双向方差分析Bonferroni紧随其后,Dunnett,图基或Sidak的多重比较测试中进行了使用GraphPad棱镜9 (GraphPad软件)(也见图传说的更多细节)。统计分析的结果提出了在每一个人物。gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

报告总结gydF4y2Ba

进一步研究信息设计是可用的gydF4y2Ba自然投资组合报告总结gydF4y2Ba与这篇文章有关。gydF4y2Ba