文摘
全基因组的合成提供了一种强大的方法来理解和扩大生物功能1,2,3。迅速建立大型基因组,可伸缩的,同时,我们需要(1)的方法组装megabases DNA短前兆和(2)策略快速和可伸缩的取代生物体的基因组DNA合成DNA。这里我们开发细菌人工染色体(BAC)逐步插入合成(基础)——megabase-scale组装的DNA的方法大肠杆菌游离体。我们使用的基础上组装1.1 Mb的人类DNA包含许多外显子,内含子,重复序列,G-quadruplexes,长时间运行和短点缀的核元素(和正弦行)。构建合成基因组为基础提供了一个强大的平台不同的生物体。我们还开发了连续基因组合成(CGS)——不断地取代顺序的方法100 kb的延伸大肠杆菌与合成DNA基因组;研究生院理事会最小化跨界车1,4合成DNA和基因组之间的输出为每个100 kb更换提供,没有排序,输入下一个100 kb的替代品。使用研究生院理事会,我们合成的0.5 Mb部分大肠杆菌基因序列总合成的重要中间体1从五个游离在10天。通过并行CGS并结合快速寡核苷酸合成和游离基因组装5,6以及快速的方法编译一个从轴承不同的菌株基因组合成基因组部分1,7,8,我们预计它将有可能合成整个大肠杆菌从功能基因组设计在不到2个月。
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数据可用性
在这项研究中使用的序列和设计细节是可用的补充数据。补充数据1提供所有间隔序列用于排和实验基础。补充数据2列出所有寡核苷酸,核苷酸序列的质粒和BACs用于这项研究。补充数据3提供的基因库文件间隔质粒pKW3表达普遍的间隔设置1。补充数据4提供的基因库文件间隔质粒pKW3表达普遍的间隔设置2。补充数据5提供一般的基因库文件排BAC设计间隔序列的通用间隔设置1。补充数据6提供一般的基因库文件排BAC设计间隔序列的通用间隔设置2。补充数据7提供的质粒pLF118基因库文件λ-red recombineering。补充数据8提供的基因库文件雌性生殖道BAC01。补充数据9提供的基因库文件雌性生殖道BAC02。补充数据10提供的基因库文件雌性生殖道BAC03。补充数据11提供了详细的结果序列验证,列出所有呼吁最终变异及其分类雌性生殖道组装。补充数据12列出所有原始测序数据,包括NCBI SRA加入数字,BioProject沉积PRJNA962525。补充数据13提供文件的质粒pFR015用于retron-editing基因库。补充数据14提供文件的辅助质粒pFR156 retron-editing基因库。补充数据15提供质粒的基因库文件pHBA008,用作模板来放大为人类BAC适应基础组件。补充数据16提供质粒的基因库文件pHBA010,用作模板来放大为人类BAC适应基础组件。补充数据17提供的基因库文件初始装配受体质粒pHBA031 1.1 Mb的基础上组装。补充数据18提供了详细的结果序列验证,列出所有真正积极的变异呼吁最后的1.1 Mb的基础上组装。补充数据19提供了详细的结果序列验证,列出所有变体作为呼吁最后组装和1.1 Mb基础分为可能假阳性或假阳性。补充数据20.提供质粒的基因库文件pSP43 CRISPR-Cas9-mediated间隔序列基因敲除的乳沟和λ-red recombineering。所有其他数据集的生成和/或分析本研究可从相应的作者以合理的要求。所有材料(补充数据3,4,7- - - - - -10,13- - - - - -17和20.)从本研究可从相应的作者以合理的要求。
代码的可用性
代码用于生成重新编码景观(https://github.com/JWChin-Lab/recoding-landscape-generator);对序列数据比对和分析(https://github.com/JWChin-Lab/NGS-analysis);进行分析的基础上构造(https://github.com/JWChin-Lab/BASIS-sequence-analysis);为下一代测序和自动化液体处理库制备(https://github.com/JWChin-Lab/NGS-sample-prep)可在GitHub上。
引用
Fredens, j . et al .总合成大肠杆菌记录的基因组。自然569年,514 - 518 (2019)。
吉布森,d . g . et al .完整的化学合成,装配,和克隆尿道支原体基因组。科学319年,1215 - 1220 (2008)。
吉布森,d . g . et al .创建一个细菌细胞由化学合成基因组控制的。科学329年52-56 (2010)。
王,k h . et al .定义同义密码子基因组重新编码的压缩方案。自然539年59 - 64 (2016)。
吉布森,d . g . et al .酶组装几百个碱基的DNA分子。Nat方法。6,343 - 345 (2009)。
Kouprina: & Larionov诉焦油克隆:洞察基因功能、远程单和基因组结构和进化。Nat,启麝猫。7,805 - 812 (2006)。
王,K。,de la Torre, D., Robertson, W. E. & Chin, J. W. Programmed chromosome fission and fusion enable precise large-scale genome rearrangement and assembly.科学365年,922 - 926 (2019)。
马:J。,Moonan, D. W. & Isaacs, F. J. Precise manipulation of bacterial chromosomes by conjugative assembly genome engineering.Protoc Nat。9,2285 - 2300 (2014)。
罗伯逊,w·e . et al .密码子重新分配使病毒抵抗和编码的聚合物合成。科学372年,1057 - 1062 (2021)。
的消息,j . f . et al .重构基因代码启用双向遗传隔离。科学378年,516 - 523 (2022)。
Nyerges, A . et al .交换遗传密码防止病毒感染和基因转移。自然615年,720 - 727 (2023)。
Spinck, m . et al。基因细胞合成非天然的肽和depsipeptide重点。Nat,化学。15,61 - 69 (2023)。
理查森,s m . et al .设计合成的酵母基因组。科学355年,1040 - 1044 (2017)。
Lajoie, m . j . et al .基因记录生物扩大生物功能。科学342年,357 - 360 (2013)。
Ostrov、n等。设计、合成和测试57-codon基因组。科学353年,819 - 822 (2016)。
刘,黄懿慧et al。细菌基因组的大规模重新编码迭代recombineering DNA的合成。核酸Res。45,6971 - 6980 (2017)。
和记黄埔,c . a .第三et al。最小的细菌基因组的设计和合成。科学351年aad6253 (2016)。
邵,y等。创建一个功能性单条染色体酵母。自然560年,331 - 335 (2018)。
Giani, a . M。,Gallo, G. R., Gianfranceschi, L. & Formenti, G. Long walk to genomics: history and current approaches to genome sequencing and assembly.第一版。结构体。Biotechnol。J。189-19 (2020)。
着陆器,e . s . et al。最初的人类基因组的测序和分析。自然409年,860 - 921 (2001)。
尼尔,d . l . et al .结构不稳定的人类衔接着重复DNA序列克隆酵母人工染色体向量。核酸Res。18,1421 - 1428 (1990)。
Haubold, b & Wiehe t .基因组重复吗?BMC Bioinform。https://doi.org/10.1186/1471 - 2105 - 7 - 541(2006)。
Yoneji, T。,Fujita, H., Mukai, T. & Su’etsugu, M. Grand scale genome manipulation via chromosome swapping in大肠杆菌程序由三个megabase染色体之一。核酸Res。49,8407 - 8418 (2021)。
Yu d . et al .染色体工程的高效的复合系统大肠杆菌。Proc。《科学。美国97年,5978 - 5983 (2000)。
Mejia j . e . & Larin z,组装的大型BACs体内重组。基因组学70年,165 - 170 (2000)。
向井亚纪,t . et al .克服megabase-sized质粒建设的挑战大肠杆菌。ACS合成器。医学杂志。9,1315 - 1327 (2020)。
Kotzamanis, g . &赫胥黎,c·巴重叠成一个更大的BAC结合起来制成的。生物科技BMC》。41 (2004)。
大学二年级生,b . l . &位咨询专家,a . r .高效recombination-based细菌人工染色体融合和诱变的方法。基因371年,136 - 143 (2006)。
洛维特,s t细菌应激反应第二版(eds Storz g . & Hengge r) 205 - 228 (2011);https://doi.org/10.1128/9781555816841.ch13。
Anstey-Gilbert c . s . et al .的结构大肠杆菌在皮瓣内切酶ExoIX-implications DNA结合和催化作用。核酸Res。41,8357 - 8367 (2013)。
刘,Y。,Kao, H. I. & Bambara, R. A. Flap endonuclease 1: a central component of DNA metabolism.为基础。学生物化学启。73年,589 - 615 (2004)。
埃尔斯沃思·r·e·等。比较人类和小鼠基因组序列分析的囊性纤维化跨膜电导调节基因。Proc。《科学。美国97年,1172 - 1177 (2000)。
Krzywinski, m . et al .一系列的BAC克隆生成人类基因组。核酸Res。32,3651 - 3660 (2004)。
雪莉,s t等人dbSNP: NCBI数据库的遗传变异。核酸Res。29日,308 - 311 (2001)。
太阳,j . x等。人类的直接描述基于微卫星的突变。Nat,麝猫。44,1161 - 1165 (2012)。
Szklarczyk, d . et al . 2021年字符串数据库:可定制的蛋白质网络和多年的功能特征基因/计量集。核酸Res。49,10800 - 10800 (2021)。
van der东,j . & Patinios c基因组编辑革命。生物科技趋势》。41,396 - 409 (2023)。
江,W。,Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.生物科技Nat。》。31日,233 - 239 (2013)。
通,Y。,Jorgensen, T. S., Whitford, C. M., Weber, T. & Lee, S. Y. A versatile genetic engineering toolkit for大肠杆菌基于CRISPR-prime编辑。Commun Nat。125206 (2021)。
Datsenko k . a &华纳、b . l .一步染色体基因的失活大肠杆菌k - 12使用PCR产品。Proc。《科学。美国97年,6640 - 6645 (2000)。
水域,v . l .细菌和哺乳动物细胞之间的结合。Nat,麝猫。29日,375 - 376 (2001)。
李·e·c . et al。完整的人性化的小鼠免疫球蛋白基因座可以有效的治疗性抗体的发现。生物科技Nat。》。32,356 - 363 (2014)。
麦克唐纳,l . e . et al .精确和原位基因人性化6 Mb的老鼠免疫球蛋白基因。Proc。《科学。美国111年,5147 - 5152 (2014)。
伯明翰Pansegrau, w . et al。完整的核苷酸序列IncPαplasmids-compilation和比较分析。j·摩尔,杂志。239年,623 - 663 (1994)。
Robertson w·e . et al .创建定制合成的基因组大肠杆菌雷克斯和起源。Protoc Nat。https://doi.org/10.1038/s41596 - 020 - 00464 - 3(2021)。
h .调整顺序读取,克隆序列和组装与BWA-MEM重叠群。预印在https://doi.org/10.48550/arXiv.1303.3997(2013)。
Danecek, p . et al .十二年SAMtools BCFtools。Gigasciencehttps://doi.org/10.1093/gigascience/giab008(2021)。
拉米雷斯,f等人deepTools2:下一代web服务器进行深度排序的数据分析。核酸Res。44W160-W165 (2016)。
麦肯纳,a . et al .基因组分析工具包:一个MapReduce框架分析下一代DNA测序数据。基因组Res。20.,1297 - 1303 (2010)。
Smolka, m . et al .全面结构性变异检测:从镶嵌到群体。预印在bioRxivhttps://doi.org/10.1101/2022.04.04.487055(2022)。
Cer, r . z . et al . Non-B DB v2.0:数据库预测Non-B DNA-forming主题及其相关工具。核酸Res。41D94-D100 (2013)。
舒伯特,m . g . et al .高通量功能变体屏幕通过体内单链DNA的生产。Proc。《科学。美国https://doi.org/10.1073/pnas.2018181118(2021)。
确认
我们感谢b . Porebski支持与下一代测序Illumina公司HiSeq系统;和y Gu d Czernecki与测序数据分析支持。这项工作是由英国医学研究理事会(MRC);MC_U105181009, MC_UP_A024_1008 J.W.C. MC_U105178808 J.E.S.), J.W. Wellcome研究员奖C (220808 / Z / 20 / Z)和康酌情授予(221267 / Z / 20 / Z) J.W.C.和J.E.S.嗜K和密度是勃林格殷格翰集团支持的溺爱和剑桥的英联邦,欧洲和国际的信任。J.W.C.和J.E.S.谢谢康桑格研究所的成员通过助理教师计划的支持。
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贡献
J.F.Z.,A.A.K.,L.F.H.F., J.B. and J.F. contributed equally to this work. J.F. and L.F.H.F. developed universal spacers. L.F.H.F. developed CONEXER. J.B., A.A.K., J.F.Z., M.S. and L.F.H.F. created host factor knockouts and investigated their consequences for CONEXER. A.A.K. and J.F.Z. established BASIS. S.G. and J.B. contributed to the construction of BASIS BACs. A.A.K., P.M., S.G. and J.F.Z. performed bioinformatic analysis for BASIS constructs. J.E.S. supervised P.M. A.A.K., J.F.Z. and F.B.H.R. modified BASIS BACs. S.G. and G.P. demonstrated CFTR expression in human cells. L.F.H.F. and J.F.Z. developed CGS. J.F.Z. implemented CGS in ∆recA细胞。K.C.L.导致自动化门店,表现型和数据分析。J.W.C.集研究和监督项目的方向。J.W.C.,A.A.K.,J.F.Z.,J。F. and L.F.H.F. wrote the paper with input from all of the authors.
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J.W.C.的创始人是建设性的生物。MRC已经提交了一份专利申请覆盖描述的工作。
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额外的信息
出版商的注意施普林格自然保持中立在发表关于司法主权地图和所属机构。
扩展数据数据和表
扩展数据图1步骤REXER-mediated集成~ 100 kb的合成DNA大肠杆菌基因组用同源区域(人力资源)特殊定位器。
雷克斯允许集成超过100 kb的合成DNA基因组(粉红色),通过更换相应的基因组DNA。细菌人工染色体(BAC)包含利益在于electroporated主管细胞的DNA合成适当的标记基因,细胞也含有一个辅助质粒编码Cas9蛋白质和λ红复合组件。选择辅助质粒(+ 5)和BAC (+ 2)。克隆细胞然后扩大和阿拉伯糖诱导表达辅助质粒基因和electrocompetent再次。HR-specific间隔数组(plasmid-based如图所示,或线性DNA)然后electroporated进入细胞;这导致CRISPR / Cas9介导在活的有机体内合成DNA的切除,两侧是两个选择磁带(+ 2 /−2)和小时基因组BAC。λ红复合机械然后使用小时直接切除DNA整合到基因组。三角形表示Cas9乳沟网站在小时(灰色盒子)侧翼合成DNA。选择对四环素(维护+ 5),氨苄青霉素(+ 6)维护,氯霉素(维护+ 2),链霉素(失去−1)确保只有细胞重组发生在整个部分的生存。可选的标记是+ 1,蓝色,菅直人R与卡那霉素(选择);−1,黄色,rpsL(选择与链霉素);+ 2,绿色,猫与氯霉素(选择);−2,粉色,sacB与蔗糖(选择);+ 5,深蓝色春节R(选择与四环素);+ 6,红ampR与氨苄青霉素(选择)。
扩展数据图2步进式排过程的描述。
一个排的一个奇怪的一步,受体细胞+ 1 /−1双选择磁带的基因组(+ 1,菅直人R(卡那霉素所带来的增长);−1rpsL(授予对链霉素敏感)和四环素抗性(+ 5,春节R(授予耐四环素))授予质粒编码阿拉伯糖诱导λ红色组件和Cas9与供者细胞混合,发现琼脂板。供者细胞包含一个奇怪的BAC和不可转让的F的质粒。在孵化的板(1 h, 37°C) BAC共轭从供体受体细胞。随后,细胞被洗板和接种在媒体选择性含有四环素(选择维护+ 5)和氯霉素(选择获得+ 2),这个选择已经收到了BAC的受体细胞。阿拉伯糖也添加到诱导λ红色组件和Cas9;切除的线性与基因组DNA和复合诱导在这一步。细胞恢复在媒体选择性含有四环素(选择维护+ 5)和氯霉素(选择维护+ 2),但没有阿拉伯糖;这个选择已经收到了BAC的受体细胞。最后,选择性琼脂板上镀细胞含有四环素(选择维护+ 5)——选择受体细胞,氯霉素(选择维护+ 2),选择的基因组整合+ 2 /−2双选择磁带的BAC,和链霉素(选择−1)的损失-选择的损失+ 1 /−1双选择磁带的基因组BAC骨干和损失。b排的,在一个更一步,受体细胞+ 2 /−2双选择磁带的基因组(+ 2,猫(授予增长对氯霉素);−2,sacB(授予对蔗糖)和四环素抗性(+ 5春节R(授予耐四环素))授予质粒编码阿拉伯糖诱导λ红色组件和Cas9与供者细胞混合,发现琼脂板。供者细胞包含一个奇怪的BAC和不可转让的F的质粒。在孵化的板(1 h, 37°C) BAC共轭从供体受体细胞。随后,细胞被洗板和接种在媒体选择性含有四环素(选择维护+ 5)和卡那霉素(选择获得+ 1);这个选择已经收到了BAC的受体细胞。阿拉伯糖也添加到诱导λ红色组件和Cas9;切除的线性与基因组DNA和复合诱导在这一步。细胞恢复在媒体选择性含有四环素(选择维护+ 5)和卡那霉素(选择维护+ 1)但没有阿拉伯糖;这个选择已经收到了BAC的受体细胞。最后,选择性琼脂板上镀细胞含有四环素(选择维护+ 5)——选择受体细胞,卡那霉素(选择维护+ 1)——选择基因组整合+ 1 /−1双选择磁带的BAC,蔗糖(选择失去−2),选择的损失+ 2 /−2双选择磁带从基因组和4-CP(选择失去−3)——选择BAC骨干的损失。c克隆从排实验选选择板。他们长大了单独在一个96孔板和表型选择标记的功能,在琼脂板上。随后,显示正确的克隆生长表型(甚至步骤:增长+ 1−2;没有增长−1 + 2;奇怪的步骤:增长−1 + 2;没有增长+ 1−2)由门店测序。可选的标记是+ 1,蓝色,菅直人R与卡那霉素(选择);−1,黄色,rpsL(选择与链霉素);+ 2,绿色,猫与氯霉素(选择);−2,粉色,sacB与蔗糖(选择);−3,橙色,ph值*(选择反对4-chlorophenylalanine);+ 5,深蓝色,春节R与四环素(选择)。
扩展数据图3雌性生殖道大会通过的基础上。
一个受体细胞包含基础装配BAC的第一部分雌性生殖道基因和质粒编码Cas9和λ红色组件与供者细胞混合。供者细胞包含基础BAC编码的第二部分雌性生殖道基因和不可转让的F的质粒。供体BAC共轭到受体细胞(A)和受体细胞选择四环素(+ 5,春节R(授予耐四环素))。在诱导蛋白表达的辅助质粒,线性dsDNA从捐赠者BAC切除(B)。切除DNA插入到装配BAC HR1上和表之间的关系。潮霉素选择(选择获得+ 3)——选择增益选择磁带的捐赠者BAC,蔗糖(选择失去−2),选择选择磁带的损失从捐赠者的组装BAC和损失BAC骨干,四环素(选择维护+ 5)——选择辅助质粒的维护,确保只有细胞正确组装BAC生存。在步骤2中,受体细胞含有BAC的第一和第二部分雌性生殖道基因和质粒编码Cas9,λ红色组件与供者细胞混合。供者细胞包含基础BAC编码的第三部分雌性生殖道基因和不可转让的F的质粒。供体BAC共轭到受体细胞(A)和受体细胞选择四环素(+ 5,春节R(授予耐四环素))。在诱导蛋白表达的辅助质粒,线性dsDNA从捐赠者BAC切除(B)。切除DNA插入到装配BAC的HR2和表之间的关系。选择氯霉素(选择获得+ 2)——选择增益选择磁带的捐赠者BAC), 4-CP(失去−3)——选择损失选择磁带的组装BAC,链霉素(−1)损失-选择捐赠BAC骨干的损失,和四环素(维护+ 5)——选择辅助质粒的维护,确保只有细胞正确组装BAC生存。b克隆从基础实验选选择板。他们长大了单独在一个96孔板和表型选择琼脂板上标记的功能。随后,克隆显示正确的在某些情况下生长表型和基因型的装配连接PCR(步骤1:生长在潮霉素,生长在蔗糖;4-CP上没有增长,对氯霉素没有增长,多用于插入的第二部分雌性生殖道(引物见补充数据2);步骤2:4-CP增长,增长chlopramphenicol;没有增长对潮霉素,没有增长蔗糖)被上天测序。可选的标记是+ 3,紫色,hygR(选择潮霉素);−3、橙ph值*(选择反对4-chlorophenylalanine);+ 2,绿色,猫与氯霉素(选择);−2,粉色,sacB与蔗糖(选择);−1、黄色rpsL(选择与链霉素);+ 5,深蓝色,春节R与四环素(选择)。
扩展数据图5•巴由基础可以广泛地修改λ红色recombineering和retron-mediated编辑生成插入,替代品和编辑。
一个为表达人类组织培养,内生雌性生殖道启动子换成了一个EF1alpha组成型启动子使用λ-red recombineering。为此EF1alpha启动子被耦合到一个氨苄青霉素抗性基因(+ 6,红色ampR(授予抗氨苄青霉素))。后recombineering细胞选择氨苄青霉素(选择增加+ 6)-选择替代的促进剂。序列的报道EF1alpha提词员(最大覆盖率显示在括号中)所示。b巴,由基础可以使用retron-mediated精确编辑编辑。一个链结合蛋白和一个包含所需的碱基对retron替换包含BAC的靶细胞表达。在复制的retron退火后随链导致所需的编辑。我们纠正两个点突变的外显子15雌性生殖道基因(方法)。桑格测序的痕迹显示包含点突变的区域(最高-红色)之前和之后(底-绿色)编辑。c区分BAC编码雌性生殖道从内生基因一个HA-tag插入外显子17的雌性生殖道BAC基因。这个标签被容忍的互补雌性生殖道4。首先,双重选择磁带(+ 3,橙色hygR(授予抗潮霉素);−3、紫色ph值*(授予灵敏度4-CP))插入到感兴趣的轨迹。后recombineering细胞选择潮霉素(选择获得+ 3)——选择插入的双重选择磁带。随后,λ-red recombineering被用来取代双选择磁带HA-tag。4-CP recombineering细胞后选择(选择−3)的损失——选择的替代选择磁带的两倍。序列的报道外显子17显示了包含HA-tag(最大覆盖显示在括号中)。
扩展数据图6的表达雌性生殖道从修改基础BAC在哺乳动物细胞。
一个,一个208 kb的示意图雌性生殖道BAC:整个人类雌性生殖道基因与一个HA-tag(黄线)表示在一个本构EF1alpha启动子。本机记录,包括外显子和内含子是拼接形成了成熟的成绩单大约4.5 kb的长度。此外,EGFP和新霉素(Neo)电阻从本构CAG启动子表达。b从人类胚胎肾,流式细胞仪(HEK293)细胞的转染雌性生殖道BAC (CFTR-HA_GFP)和控制(WT)。在x轴上显示GFP蛋白的荧光强度。在y轴side-scattering显示。大约1.19%的细胞转染雌性生殖道BAC GFP阳性。c、PCR进行cDNA从细胞和转染雌性生殖道BAC。乐队(约4.5 kb)对应的扩增子雌性生殖道成绩单是特定于细胞的转染雌性生殖道BAC。带尺寸的梯子左侧(灰色箭头)表示。实验c在一个生物复制了。d所示,挥动的PCR产品(c)表明,雌性生殖道转录和转染后细胞内妥善处理。存在HA-tag的记录表明,BAC编码记录来源于基础雌性生殖道。增加报道的侧翼可能源于测序引物。
扩展数据图7分析基因功能的1.1 Mb 21号染色体上的目标区域。
分析基因的分布特性1.1 Mb的目标地区的人类基因组组装的基础。这个地区的基因组特性比较基因组的分布特性在整个基因组,计算1 Mb的窗户。红色线表示的分数为1.1 Mb的目标地区每个基因组特性。蓝线表示中位数对每个基因组特性对整个基因组。虚线代表5th和95年th百分位的分布。
扩展数据图8排实验合成DNA序列不能被记录。
一个,密码子yceQ职位37 213年,37岁的227年,37岁的251(绿色箭头所示),在100 k09,不能被记录合成DNA TCG的密码子替换与AGC、柠檬酸与AGT密码子替换,和标签密码子TAA所取代。每一个图显示了一个编译重新编码在WT遗传背景(蓝色)和景观∆recA(红色)。景观生成由一个独立的排13 - 16测序克隆实验排BAC轴承100 k09记录序列。诊断的解决景观(第一个和最后一个事件的位置之间的距离和重新编码频率0)在括号中表示。每个实验显示的三个独立的复制。b条形图的诊断解决100年WT k09和排实验部分∆recA条件;独立生物复制数据从n = 3所示的面板一个。数据表示为平均值+ /−标准偏差。的∆recA条件明显优于WT在本地化不允许合成序列(双面未配对t测试:假定值= 0.021)。我们注意到先前的实验在雷克斯WT背景产生了一项决议> 20000个基点1。
扩展数据图9连续基因组合成方法。
偶数和奇数交替轮排连续更换与合成DNA基因组DNA。一个之后,一个更轮排,克隆选择从一个适当的选择板含有卡那霉素(+ 1)选择增益、蔗糖(选择失去−2),4-chlorophenylalanine(选择−3)的损失,和四环素(选择维护+ 5)。克隆是放大在一夜之间,并行进行表型屏幕。放大克隆与汇集所有正确的表型。这个池服务直接作为一个奇怪的轮排的收件人。一个奇怪的轮排克隆后从一个适当的选择板含有氯霉素(+ 2)选择增益,链霉素(选择−1)的损失,和四环素(选择维护+ 5)。克隆是放大在一夜之间,并行进行表型屏幕。放大克隆与汇集所有正确的表型。该池直接服务的接受者轮排。骑自行车通过奇数和偶数轮排导致连续合成基因组的合成相应的•巴。b,殖民地从一步获得的排被选择板。他们长大了单独在一个96孔板的功能和表型选择琼脂板上标记。随后,显示正确的克隆生长表型(甚至步骤:卡那霉素(选择+ 1)增长,增长蔗糖(选择−2);没有增长链霉素(选择反对−1),没有增长氯霉素(选择+ 2);奇怪的步骤:增长链霉素(选择反对−1),增长对氯霉素(选择+ 2);没有增长对卡那霉素(选择+ 1),蔗糖(选择反对−2)上没有增长)汇集成一个文化。这种文化立即作为接收者应变排的下一个步骤。可选的标记是+ 1,蓝色,菅直人R与卡那霉素(选择);−1,黄色,rpsL(选择与链霉素);+ 2,绿色,猫与氯霉素(选择);−2,粉色,sacB与蔗糖(选择);−3,橙色,ph值(选择反对4-chlorophenylalanine);+ 5,深蓝色,春节R与四环素(选择)。
扩展数据图10连续合成记录的500 kb大肠杆菌从排BACs基因组。
连续通过轮排在基因组合成∆recA收件人。基因组DNA描述了灰色和合成记录DNA粉红色。可选的标记是+ 1,蓝色,菅直人R与卡那霉素(选择);−1,黄色,rpsL(选择与链霉素);+ 2,绿色,猫与氯霉素(选择);−2,粉色,sacB与蔗糖(选择)。每一轮的排取代大约100 kb的大肠杆菌与合成DNA基因组,需要两天。连续合成一个500 kb的合成部分大肠杆菌基因组在10天。
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的消息,参考书籍,Kleefeldt, A.A., Funke, L.F.H.et al。连续的合成大肠杆菌基因组和Mb-scale人类DNA片段组装。自然(2023)。https://doi.org/10.1038/s41586 - 023 - 06268 - 1
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