癌症实验室超越疲惫的T细胞

T细胞疲惫一词起源于老鼠无法清楚的描述慢性感染。疲惫的T细胞会产生更少的细胞因子和有较高的表达抑制受体PD-1或CTLA-4等。疲劳可能进化的自体免疫反应的免疫系统的模式。在这个意义上,宾夕法尼亚大学的John摆渡船指出,“疲惫的T细胞不是天生好或坏”¹。但在癌症、疲惫的T细胞不能有效攻击癌细胞。科学家最近发现了一个叫做胸腺细胞的转录因子selection-associated hmg盒子蛋白质(托克斯)是一种重要的编排T细胞的疲劳^2,3,4,5,6。

T细胞衰竭发生在感染和癌症,范德比尔特大学医学中心的研究员玛丽菲利普说,该托克斯工作⁴。在慢性病毒感染T细胞功能开始,然后随着感染持续刺激他们,变得疲惫和失去功能,“尽管他们可以保留足够的功能与病毒达到一个僵局,”她说。“在癌症,T细胞通常直接输入到一个非功能性的状态。”

即使他们在那种状态下,安德里亚Schietinger说,纪念斯隆凯特林癌症中心的一个研究员共同工作,肿瘤继续刺激T细胞,这取决于托克斯和细胞看起来筋疲力尽,她说。“这些不正常T细胞在肿瘤一般不做任何事,”她说。“他们只是闲逛,让肿瘤生长。“在他们的研究中,他们看着CD8托克斯⁺尖从人外周血单核细胞和黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌以及评估删除的效果托克斯在体外和老鼠。他们RNA-sequencing执行和分析用于Transposase-Accessible染色质使用排序(ATAC-seq),描述的方法紧密或松散的DNA是如何包装在整个基因组。

功能和功能失调的T细胞有相同的DNA序列;这是他们的表观遗传学,这些序列是如何表示和管理,决定细胞命运和功能,菲利普说。ATAC-seq的优势,她说,是它可以使用较低的细胞数量,一个典型的约束处理T细胞从老鼠和人类肿瘤。

不同于急性感染T细胞,T细胞在肿瘤变得疲惫,失去能力杀死,Schietinger说。他们搜遍了转录因子表达的独特的T细胞,托克斯名列榜首,她说。他们第一次发现托克斯在肿瘤小鼠模型,然后发现它表达高水平在所有人类T细胞肿瘤他们研究——在乳腺癌和肺癌,在黑素瘤和卵巢癌;”,我们相信,我们的东西,”她说。

托克斯菲利普说,这是一个惊喜,调节T细胞的许多功能疲惫但不控制T细胞效应函数,这发生在一个抗原激活幼稚T细胞武装和效应T细胞。肿瘤浸润T细胞的报废托克斯基因不再看上去疲惫不堪,但仍不正常,不杀死肿瘤细胞,菲利普说。Schietinger说,“我认为这是下一个大的问题需要回答:什么控件是否T细胞功能。”

疲惫的T细胞有一个“独特的表观遗传景观,”摆渡船措辞。他和他的同事们研究了景观与免疫沉淀反应质谱紧随其后。他们看着托克斯蛋白质绑定,从而诱导表观遗传变化。在蛋白质的参与染色质组织和重构,RNA加工、翻译。作者指出,托克斯是“关键的诱导物疲惫的典型特征。“他们注意,疲惫的T细胞是“不同的细胞类型,“独立于T细胞亲属如T效应细胞或T记忆细胞。

T细胞衰竭形状研究有关工程T细胞攻击肿瘤,如嵌合抗原受体(汽车)T细胞的方法⁷。卡尔在宾夕法尼亚大学和他的同事6月先进CAR-T疗法,病人的T细胞具有合成受体分子,然后注入到病人。斯坦福大学的研究人员水晶几座,霍华德Chang和他们的同事们指出,CAR-T治疗是成功的在一个“小子集的病人”⁸。

但是T细胞疲劳是一个问题。常和他的同事应用单细胞ATAC-seq (scATAC-seq)来识别成千上万的“访问”染色质区域和定位与疲劳相关的基因⁹。“主导信号在我们scATAC-seq工作建议参与c-JUN AP1通路,”Chang说。加上水晶几座的小组,他们工程小鼠c-JUN过表达,AP-1-family转录因子。CAR-T细胞成为抗疲劳和功能更强大的他们攻击癌症,他说。他们检测了细胞免疫力低下小鼠接种了白血病或骨肉瘤。

几个关键转录因子似乎T细胞疲劳驾驶,Chang说,在他的实验室ATAC-seq发达。在ATAC-seq,核与转座酶暂停,其次是条码和测序。他和他的团队也开发了scATAC-seq方法集成到可编程Fluidigm微流体平台。的第一个版本scATAC-seq可以处理96个体细胞试验。“我们知道我们必须处理数以千计的试验规模如果不是数以万计的细胞应对高度异构的细胞,存在于复杂的组织,”Chang说。Droplet-based scATAC-seq给他们大规模并行规模评估基因组及其dna结合蛋白质。在一个实验中,他们分析了200000个细胞。scATAC-seq有各种协议,10倍基因组学,例如,提供了一个工具。

常乐观地认为单细胞表观基因组学将有助于改善癌症免疫疗法。小舟和其他人已经报道,疲惫的T细胞有明显的表观遗传状态和染色质模式,所以“T细胞疲劳可能是一个好的系统应用我们的新scATAC-seq技术。”常和他的同事们看着瘤内T细胞衰竭患者样本和使用scATAC-seq梳理疲惫的T细胞的规模进行分析。

另外,他们结合测序识别和单细胞RNA-sequencing评估样品之前和之后PD-1封锁。疲惫的T细胞PD-1封锁后不会重新出现。相反,Chang说,一批新的T细胞进入肿瘤和扩张。“这个“克隆替代”的概念是一个重要的新方向对癌症免疫治疗,”他说。

疲惫的T细胞的染色质模式”一样的任何其他通常被认为是T细胞状态,“说Ansuman Satpathy还,还在斯坦福大学和合作者的工作。“使用单细胞的数据,我们可以地图的发展轨迹T细胞激活疲劳和提名监管元素和转录因子可能是这一过程的关键。”

另一种有价值的技术研究T细胞的疲惫,Schietinger说空间转录组,鉴于T细胞在不同的身体位置属性会有所不同,甚至在一个肿瘤。“我们兴奋的新技术新兴允许我们将转录组与位置信息,”她说。“托克斯有很多传闻,”她说。在接下来的研究任务是“如何使糟糕的T细胞成为癌症杀手T细胞,这可能与托克斯,”她说。“所以请继续关注。”

CAR-T疗法被批准治疗一些血液癌症。科学家正在探索如何避免细胞因子释放综合征(CRS),一个可能的严重的副作用CAR-T疗法,并正在调查如何CAR-T细胞可能是用于实体肿瘤。当关键的T细胞,避免疲劳和坚持肿瘤微环境。

Chang和卡尔一起6月的集团使用CRISPR——特别是gene-edited T细胞,基因编码细胞α和β链¹⁰。“实际上我们的单细胞分析表明基因编辑PD-1没有对T细胞的持久性产生重大影响,”Chang说。什么可以帮助与T细胞持久性时,他们发现,敲出内生T细胞受体基因。与汽车的一个问题是错配的工程细胞内源性的。错配的风险是低的内源性细胞时,他说。这个解释也同意研究的优势内生识别位点特异的细胞插入。

CRISPR编辑T细胞不需要局限于基因,Satpathy还说,她的基因编辑工作。“编辑cell-context-specific增强剂也可以有利于实现更精确的控制基因的表达,”他说。

一个挑战目前批准的汽车T方法,施瓦茨说,汽车T细胞是用来确定一个特定的肿瘤抗原,如CD19的淋巴瘤。“肿瘤细胞进化和变异,可以表达下调这些抗原,”她说。这些T细胞灭活肿瘤可以开发机制。“新方法目标多个抗原,但我认为,更大的问题是我们需要方法,目标更大范围的肿瘤抗原和持久,”她说。这将需要更多的基础研究,例如,旁观者T细胞激活的微妙之处,抗原蔓延,以及怎样才能保持一个健壮的记忆T细胞,她说。

癌细胞表达主要组织相容性类我(MHC)蛋白质表面,T细胞选择巡逻,菲利普说。不同特异性T细胞有不同的肽,当一个特定的T细胞识别多肽对癌细胞的MHC I T细胞被激活。“但上下文,或微环境,起着很大的作用的T细胞功能一旦被激活,”她说。在癌症中,微环境可能导致非功能性的T细胞,无法杀死癌细胞。癌症细胞积累,他们将继续刺激T细胞通过peptide-MHC我和T细胞会变得疲惫不堪。

scATAC-seq方法证明的规模有助于分析问题与肿瘤微环境,Satpathy还说。在一个试验,他们可以获取配置文件的所有细胞肿瘤微环境。例如,他们看到一个“exhaustion-like”分化CD4的轨迹⁺细胞,导致一种T细胞称为卵泡辅助T细胞。这些细胞尤其善于支持B细胞的反应,他说。在病人的疾病对免疫疗法,团队看到CD8的扩张⁺疲惫的T细胞。CD4⁺T卵泡辅助细胞和B细胞,所有这些表明,协调免疫反应。其他组织表明,B细胞在肿瘤微环境的存在“检查站反应的是一个积极的指标,”他说。

肿瘤微环境在许多方面似乎免疫抑制。免疫反应是由很多不同的因素,和免疫治疗结果整合所有的这些影响,施瓦茨说。在肿瘤微环境之间的相互作用有互相依赖,。在她的实验室和其他研究人员探索系统动力学——不同的细胞类型,如何抑制刺激受体、细胞因子一起合作和相互影响。

转录组收益并不了解交互,每个细胞的基因表达状态。“我们需要更好的工具来理解复杂的免疫反应动力学,”施瓦茨说。她和她的团队正在致力于一个肿瘤免疫微环境的体外模型,使用体外肿瘤和tumor-draining淋巴结。“这仍然需要进一步发展很有用,但是我认为这样的工具对理解细胞的方式将起到至关重要的作用,在免疫微环境共同进化和互动的挑战。“除了T细胞和微环境,一些组织探索自然杀伤(NK)细胞的修改来表达anti-CD19汽车。

“总是伟大的模型作品,“Janell理查森说,泰康利生物科学领域应用科学家发展啮齿动物模型,包括转基因的客户。“但是,最重要的是,我们还想知道,当它不工作,它为什么不工作。“当为癌症研究人员创造小鼠模型,特别是在immuno-oncology,她和她的团队想要了解模型的预测效度。

已经变得明显,肿瘤的总突变负担问题,不仅仅是肿瘤,例如,表达高水平的PD-L1。多少人知道这些“热”肿瘤,炎症水平表明许多尖。“我认为,困难的部分是:感冒肿瘤呢?”她说。寒冷的肿瘤有时被称作“沙漠”,因为他们缺乏免疫细胞。研究问题”是有办法过渡感冒肿瘤肿瘤热吗?“是许多开放的人之一,她说。

在她的客户,她看到basic-research-oriented动作。一个例子是盯着超越PD-1等专注于一个目标。这些方法在一些癌症,“但我们看到很多挫折,”她说,“因为当然,它是不成功的。“回归基本涉及更复杂的,广泛的范围问题。“现在我们知道,它也不仅仅是T细胞,”她说。她看到实验室探索角色的基质细胞在肿瘤微环境中,myeloid-derived抑制细胞,肿瘤相关巨噬细胞抑制性受体和细胞因子。有支持淋巴和骨髓细胞和它们之间有相声,所有这些都有助于解释癌症的免疫系统反应。似乎,肿瘤相关巨噬细胞可以直接影响总体免疫抑制环境,可以myeloid-derived抑制细胞。这将是富有成果的理解机制T细胞的疲劳。“如果他们在疲惫,然后他们会在重新振作,”理查森说。

体内系统非常适合探索复杂,multiparallel系统内部和外部的信号,她说。但老鼠也有其局限性。“一些老鼠不显示细胞因子释放综合征,”她说。一个免疫疗法临床试验导致严重,危及生命的细胞因子风暴。更高的剂量已经没有显示CRS在非人类灵长类动物身上进行测试。“它告诉你这个系统的复杂性和物种特异性,”她说。

CRS已经人性化所示如如CD34免疫系统模型⁺道NOD / SCIDγ鼠标。它发生,淋巴和骨髓免疫血统需要礼物,理查森说。但是这些老鼠”通常是一个非常lymphoid-dominant谱系模型,”她说。“模型是远非完美,”她说。需要更好的方法来建模CRS那么实验室可以支撑这个反应。

理查森和她的团队正在推进人性化免疫系统移植的模型来获得更深的理解。在移植外周血单核细胞或胎儿脐带血造血干细胞血液道成“super-immunodeficient”动物,使淋巴,可能骨髓隔间。因为这些老鼠有一个不完整的免疫系统,一个人类和老鼠的组件,她提醒客户锻炼要谨慎解释结果。

她和她的团队正在致力于下一代人性化免疫系统模型:模型与内生人类细胞因子。这些模型通常将包含细胞缺失或出席super-immunodeficient老鼠只有非常低的水平,并有可能要求更复杂的研究问题,她说。

理查森建议客户记得结果可能同系的小鼠模型之间的差异,这是“基本老鼠肿瘤的老鼠主机”——一个具有相同遗传背景和人性化的小鼠模型。一些免疫治疗研究显示不同的结果在这两个模型类。

在应用研发,她发现一些桥梁建设。传统上,科学家在肿瘤科工作或自身免疫性疾病:“他们会对他们的工作在孤立的活动,”她说。但是科学家现在看到immuno-oncology目标已经失败了,没有“脱钩”抑制自身免疫性疾病可能会承诺,这是一个明确的目标,抑制免疫反应。

热肿瘤欣然承认T细胞,但是一旦在,他们可以被困,反复刺激,变得疲惫,Schietinger说。“冷肿瘤不敞开大门让T细胞。“冷热肿瘤需要不同的方法:“在肿瘤热我需要找出如何防止T细胞筋疲力尽,在寒冷的肿瘤,我需要弄清楚我是如何得到我的T细胞在肿瘤的门。”

肿瘤与T细胞发炎或更多渗透一般反应更好检查点封锁,施瓦茨说。一些黑色素瘤lymphangiogenic更容易转移,和她和她的团队发现lymphangiogenic肿瘤免疫疗法更加敏感¹¹。VEGF-C lymphangiogenic生长因子,淋巴自导趋化因子CCL21上调。这吸引了天真和记忆T细胞进入肿瘤,以及树突细胞,所有CCL21受体CCR7。“因此,一旦发起免疫疗法和T细胞杀死肿瘤细胞的发生,这些“旁观者”的天真和记忆T细胞也可以激活,放大和扩大免疫反应,”她说。抑制VEGF-C恶化对免疫疗法的反应;“这是我们的惊人的发现——这表明,即使VEGF-C被认为是坏的转移,它可以有利于免疫疗法”。

患者对免疫疗法更频繁更有发炎的“热”肿瘤。这是有关检查点封锁”,因为如果你不有T细胞首先,用处不大,以防止他们的疲惫,”她说。另一方面,有许多其他类型的免疫疗法,如CAR-T细胞,树突状细胞疫苗,和蛋白质或肽疫苗。预先存在的炎症可能扮演不同的角色在细胞CAR-T方法和检查点封锁。

不同的肿瘤免疫治疗可以有不同的障碍,这也取决于不同的免疫治疗问题,施瓦茨说。细胞还需要考虑包括myeloid-derived抑制细胞,M2巨噬细胞和调节性T细胞,抑制细胞毒性T细胞功能。癌症相关的成纤维细胞可以排除T细胞进入肿瘤,还有表达抑制分子PD-L1。在她看来,科学家想要描述的整体免疫微环境,争取更多细节,超越热与冷的分类。